Name: cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel
Uploaded: 2012-01-11T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel at JoVE.com

Författarna vill tacka Norman Krüger för hans utmärkta teknisk support.

1. Del 1: Kultur i hNPCs i PuraMatrix <ol><li> I förväg till den generationen av en byggnadsställning med en PuraMatrix koncentration på 0,25% utan laminin man behöver förbereda följande lösningar </li><li> Bered en lösning som innehåller 20% sackaros och en lösning som innehåller 10% sackaros löst i sterilt destillerat vatten. </li><li> För lösningen en mix 120 ìl av 20% sackaroslösning med 120 l destillerat vatten i en 1,5 ml konisk rör. </li><li> För lösning 2 mix 60 ìl av PuraMatrix lösning m...

<ol>
	<li>Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+3D+tissue+cell+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures.</a> Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).</li><li>Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+scaffolds+for+3-d+tissue+cell+cultures+and+regenerative+medicine.">Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine.</a> Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).</li><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+building+a+better+matrix.">Cell Culture: building a better matrix.</a> Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).</li><li>Hauser, C. A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+biological+materials.">Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).</li><li>Teng, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recovery+following+traumatic+spinal+cord+injury+mediated+by+a+unique+polymer+scaffold+seeded+with+neural+stem+cells.">Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).</li><li>Silva, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+differentiation+of+neural+progenitor+cells+by+high-epitope+density+nanofibers.">Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers.</a> Science. 303, 1352-1355 (2004).</li><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).</li><li>Taraballi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine-spacers+influence+functional+motifs+exposure+and+self-assembling+propensity+of+functionalized+substrates+tailored+for+neural+stem+cell+cultures.">Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures.</a> Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).</li><li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane.">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).</li><li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+oligopeptide+matrices+support+mammalian+cell+attachment.">Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment.</a> Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).</li><li>Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+significantly+enhance+osteoblast+proliferation,+differentiation+and+3-D+migration.">Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration.</a> PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).</li><li>Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+of+human+fetal+neural+stem+cells+with+hydrogel+biomaterials+in+vitro.">Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro.</a> Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).</li><li>Ortinau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells.">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).</li><li>Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PuraMatrix+Encapsulation+of+Cancer+Cells.">PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1692-e1692 (2009).</li><li>Morgan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+neurons+derived+from+human+neural+progenitor+cells+by+veratridine.">Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine.</a> Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).</li><li>Giese, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+the+effect+of+oxygen+during+proliferation+and+differentiation+of+human+neural+progenitor+cells.">Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells.</a> BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).</li><li>Schm&#246;le, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+indolylmaleimide+acts+as+GSK-3beta+inhibitor+in+human+neural+progenitor+cells.">Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells.</a> Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).</li><li>PuraMatrix, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Hydrogel.">Peptide Hydrogel.</a> Guidelines for Use. Catalog No 354250, (2006).</li></ol>

Användandet av 3D-ställningar ger möjlighet att studera utvecklingen av olika celltyper i en cellkultur situation närmare in vivo-situationen. Men när det gäller analysen av t.ex. neuronal differentiering eller funktionella studier man måste övervinna vissa hinder för att få tillförlitliga data för t.ex. kvantifiering av celltyper. Här har vi beskrivit kulturen i hNPCs i peptid hydrogelen baserade schavotten PuraMatrix och sedan frigöra de celler som skall användas f?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> PuraMatrix peptid hydrogel </td><td> BD Bioscience </td><td> 354.250 </td><td></td></tr><tr><td> Mus laminin jag </td><td> Cultrex </td><td> 400-2009090 </td><td></td></tr><tr><td> Sackaros </td><td> Sigma </td><td> S9378-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Normal get serum </td><td> Dako </td><td> X0907 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Biochrom AG </td><td> L 1825 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-088 </td><td> Hanks Balanced Salt Solution 1X </td></tr><tr><td&gt; ΒIII-tubulin antikropp </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-51.670 </td><td> Mus, monoklonala, 1:500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> En 11.029 </td><td> Goat α mus, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 </td><td> Invitrogen </td><td> En 11.031 </td><td> Goat α mus, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> En 21.235 </td><td> Goat α mus, 1:1000 </td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 Reagens </td><td> Calbiochem </td><td> 475.904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Aldrich </td><td> D2 ,780-2 </td><td> 1,4-diazabicyklo [2.2.2] oktan 98% </td></tr><tr><td> Cell sil </td><td> BD Biosciences </td><td> 352.350 </td><td> 70 ìm porstorlek </td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Merck </td><td> 7695 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin/ EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Bensonas 250 U / l </td><td> Merck </td><td> 1.01654.0001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsininhibitorerna </td><td> Sigma </td><td> T6522 (500 mg) </td><td></td></tr><tr><td> 20% HSA </td><td> Octapharma </td><td> Människa-Albumin Kabi 20% </td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel

Påverkan av 3-dimensionell (3D) ställningar på tillväxt, spridning och slutligen neuronal differentiering är av stort intresse för att hitta nya metoder för cell-baserade och standardiserade behandlingar i neurologiska sjukdomar eller neurodegenerativa sjukdomar. 3D-strukturer förväntas ge en miljö som mycket närmare in vivo situationen än 2D kulturer. I samband med regenerativ medicin, har en kombination av biomaterial ställningar med neurala stamceller och progenitorceller stort löfte som ett terapeutiskt verktyg. 1-5 Kultur system emulera en tredimensionell miljö har visat sig påverka proliferation och differentiering i olika typer av stamceller och progenitorceller. Häri, är bildandet och functionalisation av 3D-microenviroment viktigt att bestämma överlevnad och öde inbäddade cellerna. 6-8 Här har vi använt PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), en peptid baserad hydrogel schavotten,som är väl beskrivna och används för att studera inverkan av en 3D-miljö på olika celltyper. kan 7,11-14 PuraMatrix anpassas enkelt och den syntetiska tillverkningen av nano-fibrer ger en 3D-kultur system med hög tillförlitlighet, vilket är ett tillägg Xeno-fri. Nyligen har vi studerat påverkan av PM-koncentration på bildandet av den ställningen. 13 I denna studie användes koncentrationerna av PM hade en direkt inverkan på bildandet av 3D-struktur, vilket bevisas av atomkraftsmikroskopi. En uppföljande analys av överlevnad och differentiering av hNPCs visade en påverkan av den använda koncentrationerna av PM om situationen för de inbäddade cellerna. Men analysen av överlevnad eller neuronal differentiering med hjälp av immunofluorescens tekniker besitter några hinder. För att få tillförlitliga uppgifter, måste man fastställa det totala antalet celler i en matris för att få det relativa antalet t.ex.. neuronala celler som markeras med βIII-tubulin. Detta förutsättningar en teknik för att analysera ställningar i alla tre dimensioner av en konfokalmikroskop eller jämförbar teknik som fluorescens mikroskop kunna ta z-stackar av provet. Även denna typ av analys är mycket tidskrävande. Här visar vi en metod att frigöra celler från 3D-ställningar för senare analys, t.ex. med flödescytometri. I detta protokoll mänskliga neurala stamceller (hNPCs) av ReNcell VM cellinje (Millipore USA) odlades och differentierad i 3D-ställningar bestående av PuraMatrix (PM) eller PuraMatrix kompletteras med laminin (PML). I våra händer en PM-koncentration av 0,25% var optimalt för odling av cellerna 13, men koncentrationen kan anpassas till andra celltyper. De frigjorda celler kan användas för t ex immuncytokemiska studier och därefter analyseras med flödescytometri 12. Detta snabbar upp analysen och moär över, de uppgifter som erhålls vilar på en bredare bas, att förbättra tillförlitligheten i uppgifterna.

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel at JoVE.com

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Här beskriver vi användning av en självorganiserande 3-dimensionell klätterställning till kultur mänskliga neurala stamceller. Vi presenterar ett protokoll för att frigöra celler från byggnadsställningar som ska analyseras i efterhand t.ex. genom flödescytometri. Detta protokoll kan anpassas till andra celltyper för att utföra detaljerade mekaniskt studier.

Odling av mänskliga neurala stamceller i en 3-dimensionell självorganiserande Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

En metod för äggblåsa Inkapsling och kultur i ett Proteolytically Nedbrytbara 3 dimensionellt system

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Organotypisk Kollagen I Analys: en formbar plattform att bedöma Cell Beteende i en 3-dimensionell sammanhang

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

Anpassning av en haptisk robot i en 3T fMRI

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Electric Field-kontrollerad Riktad Migration av neurala stamceller i 2D-och 3D-miljöer

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Självrapporterings Ställningar för 3-dimensionell cellodling

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Syntes av ett intein medierad Artificiell Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Odling av däggdjursceller med en enda användning Pneumatic bioreaktorsystem

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Förbättrad 3D Hydrogel kulturer av primära gliaceller för In Vitro modellering av Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Odling däggdjursceller i tredimensionella peptid ställningar

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Hyaluronsyra baserat hydrogeler för 3-dimensionell kultur av patientderiverade Glioblastoma celler

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...