Name: local and global methods of assessing thermal nociception in drosophila larvae
Uploaded: 2012-05-18T13:00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae at JoVE.com

Vi takker Christian Landry for varme sondedesign, Daniel Babcock for udviklingen af larvestadiet varmen sonden analysen, Sean Sweeney for at foreslå den varme plade analysen, det Bloomington Drosophila Stock Center for fluen lagre, og Galko lab medlemmer til kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af NIH R01 NS069828 til MJG og en NIH MARC U-STAR Training Grant (T34GM079088 til University of Houston-Downtown Lærde Academy) for mindretals adgang til forskerkarrierer (AVG).

<ol>
	<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li><li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=painless,+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception.">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li><li>Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+thermosensitive+escape+behavior+in+Drosophila+larvae.">A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae.</a> Fly (Austin). 5, 17810 (2011).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons.">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li><li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hamlet,+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology.">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li><li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+regulating+dendritic+outgrowth,+branching,+and+routing+in+Drosophila.">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li><li>Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensive+responses+of+larval+Manduca+sexta+and+their+sensitization+by+noxious+stimuli+in+the+laboratory+and+field.">Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field.</a> J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).</li><li>Woolf, C. J., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptors--noxious+stimulus+detectors.">Nociceptors--noxious stimulus detectors.</a> Neuron. 55, 353-364 (2007).</li><li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li><li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+single+neurons+in+vivo+reveals+specific+roles+of+flamingo+in+neuronal+morphogenesis.">Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).</li><li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction:+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila.">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li><li>Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+silencing+of+Drosophila+pacemaker+neurons+stops+the+free-running+circadian+clock.">Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock.</a> Cell. 109, 485-495 (2002).</li></ol>

Vi har intet at afsløre.

De assays der er beskrevet her, kan anvendes til kvalitativt og kvantitativt at vurdere larver af forskellige genotyper for modtagelighed for skadelige termiske stimuli. Et væsentligt element i den varme sonden analysen er, at stimulus gives kun på et enkelt locus. Dette sandsynligvis fører til brænding af kun en lille delmængde af klasse IV neuroner-de dem i segment i kontakt med proben og måske dem, umiddelbart tilstødende segmenter 11. På grund af lokal stimulering efterligner den varme proben assayet fælles sanseoplevelse for at detektere en skadelig stimulus, der er lokaliseret til et særligt organ region, såsom en hånd at kontakte en varm ovn. En ulempe ved den varme proben assayet er, at det har en bruger til bruger variabilitet, som kan sandsynligvis tilskrives tre faktorer: i) det tryk, hvormed brugeren anvender probe til larve, ii) den nøjagtige placering af proben på larve i forhold til de underliggende nociceptive neuroner, og iii) nøjagtige angle, hvor proben er i kontakt med overfladen af ​​larver. Vi har tidligere rapporteret en kvantitativ strategi kategorisere larver i non-responders, langsomme respondenter og hurtige respondenter baseret på deres tilbagetrækning ventetid til en given temperatur 1. Her har vi rapportere om larver lydhørhed over for endnu højere temperaturer. Interessant, finder vi, at der er et loft for larver termiske nociceptive responser, og at dette loft ligger mellem 52 og 54 ° C. Dette kan indikere, larver ikke besidder en transient receptor potentiale (TRP) kanal er i stand til gating ved temperaturer højere end 52 ° C. Alternativt kunne det tyder på, at de neuroner eller muskler, der anvendes til at indlede eller udføre motorisk reaktion bliver beskadiget, før de overhovedet kan fungere i aversiv tilbagetrækning. Vi rapporterer en anden analyse af amplituden af ​​nedtrapningsrespons der anvender enten antallet af ruller som en indikator for den &quot;robusthed&quot; af reaktionen. Naivt, enville forvente, at disse parametre vil stige med stigende temperatur eller tid stimulering. Overraskende finder vi, at dette ikke er tilfældet. Larver stimuleret i længere tid ved en temperatur i den lave ende af skadelige område (42 ° C) viser flere ruller og mere tid rullende end larver probet ved højere temperaturer (48-52 ° C). Dette antyder, at i det skadelige temperaturen vinduet er det primært varigheden af ​​eksponeringen, som bestemmer amplituden af ​​responset. Idet larver udsættes for meget skadelige temperaturer (48-52 ° C) reagerer gennemsnit meget hurtigt, udviser de ikke så mange valser som larver udsættes for en mindre skadelig temperatur i et længere tidsrum. Analysen af ​​responsamplituden rapporteret her tilføjer en anden kvantitativ dimension langs hvilken forskellige genotyper eller miljømæssige manipulationer kan sammenlignes. Et væsentligt element i den varme plade analysen er, at det indebærer en global eksponering for skadeligevarme. Som sådan er det mere beslægtet med dyret sidder i en opvarmet kedel end røre en varm ovn. Selv om det ikke er klart, når en larve kan opleve en globalt skadelig stimulus i naturen, i laboratoriet de adfærdsmæssige reaktioner på denne globale eksponering er mere komplekse end dem observeret ved lokal stimulering. En styrke af varme pladeassayet, bemærkede også af andre 3, er, at den har ringe bruger-til-bruger variabilitet siden berøre larve ikke er en del af protokollen. Den eneste væsentlige afvigelse synes at være at definere, når hver adfærd begynder, og dette kan minimeres med gentaget visning / fortrolighed. En interessant forskel mellem assays er de temperaturer, ved hvilke afskrækningsmidler adfærd påbegyndes. Disse er meget lavere i den varme plade assayet end den varme proben. Den indledende adfærd, der udvises af larver i kontakt med den varme probe (hoved og hale raise) kan være en korrelere af hovedet thrash observeret ved ~ 27 ° C i den varme plate assay. Det er muligt, at dette svar afspejler &quot;ubehag&quot; mere end &quot;smerte&quot;. Vi har ikke observeret et modstykke til piskning, beslaglæggelse, og paralyse selv ved høj (op til 48 ° C) temperaturer i varmen sonden analysen og det kan være, at en kritisk masse af sensorisk neuron skyde fra mere end én region af kroppen er nødvendigt for at bringe disse adfærdsmønstre. Interessant er anfald og lammelse adfærd observeres ved temperaturer (~ 34 - 37 ° C) under den nederste ende af den nociceptive tærskel observeret med den varme probe indikerer, at den globale stimulation kan involvere summering af neuronale reaktioner, der er tilstrækkelige til at udløse opførsel med lokal anvendelse af varme probe. At disse temperaturer faktisk opfattes som skadelige for larverne understøttes af den iagttagelse, at larver at begynde lammelse adfærd og derefter lov til at komme på fly fødevarer ikke i de fleste tilfælde overleve (figur 5C). Yderligere støtter det argument, at varmen plspiste assay udlæsning nociceptive responser er det faktum, at blokering synaptisk transmission i kendte nociceptive sensoriske neuroner forøger latensen af ​​de fleste af de observerede adfærd (Figur 6). Den iagttagelse, at der ikke er nogen stigning i latenstid for den højere temperatur piskning adfærd tyder på, at andre sensoriske neuroner, som ikke udtrykker md-Gal4 kan være nødvendig for denne adfærd. Sammenfattende omfatter begge assays udsætte et individ larve til en skadelig termisk stimulus af definerede temperatur - den varme spidsen af ​​en lille metal-probe i den lokale assay og nedsænkning i en dråbe hurtigt opvarme vandet i den globale assay. Adfærdsmæssige reaktioner af Drosophila larver af varierende genetiske baggrunde og / eller udsættes for varierende miljømæssige betingelser (for eksempel plus eller minus vævsskade), kan studeres og kvantificeret under anvendelse af disse assays. I sidste ende, vil resultaterne fra disse analyser hjælpe os til bedre at forstå genetiske netværk styrer NOCiception i Drosophila og andre beslægtede arter.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Termisk Probe </td><td> Pro-Dev Engineering </td><td> Custom-byggede on demand </td><td> Kontaktoplysninger kan leveres på forespørgsel </td></tr><tr><td> Tør Bad Incubator </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718 </td><td> En fast varmeblok og en varmeblok til 16mm brønde </td></tr><tr><td> Leica DFC290 12v/400mA Farve kamera </td><td> Leica Microsystems </td><td> 12730080 </td><td> Enhver anden tilsvarende Kameraet vil gøre. </td></tr><tr><td> Leica MZ6 mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> Varenummer for MZ6 zoom kroppen (optikholderen) er 10445614 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Ace Modulamp Unit </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Dual Gooseneck 23 tommer Fiber lysleder </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> Schott A08575 </td><td></td></tr><tr><td> Termisk Control Unit </td><td> TSCI corp. </td><td> Custom Built </td><td> Nærmere oplysninger kan leveres på forespørgsel </td></tr><tr><td> Zeiss STEMI 2000 mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> NT55-605 </td><td> Enhver anden tilsvarende mikroskopvil gøre. </td></tr><tr><td> Tang </td><td> FST </td><td> FS-1670 </td><td></td></tr><tr><td> 1mm mesh </td><td> Genesee Videnskabelig </td><td> 57-101 </td><td></td></tr><tr><td> Paintbrush </td><td> Dick Blick Art Materials </td><td> 06762-1002 </td><td></td></tr><tr><td> UV-tværbinderen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1199289 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin Krukker </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-816 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml bægerglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540C </td><td></td></tr><tr><td> Diethylether </td><td> Fisher Scientific </td><td> E138-500 </td><td></td></tr><tr><td> 35 X 10 mm Polystyren petriskål </td><td> Falcon </td><td> 351008 </td><td> Vi har ikke testet alternative retter. </td></tr><tr><td> Objektglas </td><td> Corning </td><td> 26003 </td><td></td></tr><tr><td> Termoelement </td><td> Omega Engineering, Inc. </td><td> HH802U </td><td></td></tr><tr><td> Piece of vinyl </td><td> Office Depot </td><td> 480009 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrocentrifugerør </td><td> Denville VidenskabeligeInc. </td><td> C-2170 </td><td></td></tr></tbody></table>

local and global methods of assessing thermal nociception in drosophila larvae

I denne artikel, udviser vi analyser for at studere termisk nociception i Drosophila larver. En analyse involverer rumligt begrænset (lokale) stimulering af termisk nociceptorer 1,2, mens den anden involverer en gros (global) aktivering af de fleste eller alle disse neuroner 3. Sammen disse teknikker tillader visualisering og kvantificering af de adfærdsmæssige funktioner Drosophila nociceptive sensoriske neuroner. Drosophila larver er en etableret modelsystem til undersøgelse termisk nociception, en sensorisk reaktion potentielt skadelige temperaturer, der er evolutionært konserverede på tværs af arter 1,2. Fordelene ved Drosophila for sådanne undersøgelser er den relative enkelhed af nervesystemet og sofistikerede de genetiske teknikker, der kan anvendes til at dissekere den molekylære basis for den underliggende biologiske 4-6 Drosophila, som i alle metazoans de response til skadelige termiske stimuli generelt indebærer et &quot;nocifensive&quot; aversiv tilbagetrækning til den præsenterede stimulus 7. Sådanne stimuli detekteres ved frie nerveender eller nociceptorer og amplituden af organismal respons afhænger af antallet af nociceptorer modtager skadelig stimulus 8. I Drosophila, er det klasse IV dendritiske arborization sensoriske neuroner, der registrerer skadelige termiske og mekaniske stimuli 9 i tillæg til deres nyligt opdaget rolle som fotoreceptorer 10. Disse neuroner, der er blevet rigtig godt studeret på det udviklingsmæssige niveau, arborize over barrieren epidermisarket og skabe kontakt med næsten alle epidermale celler 11,12. Den enkelte axon af hver klasse IV neuron projekter i den ventrale nerve ledningen af det centrale nervesystem 11, hvor de kan forbinde til anden ordens neuroner dette projekt til hjernen. Under baseline forhold, nociceptive sensorisk neurons vil ikke fyre, indtil en relativt høj tærskel er nået. Analyserne beskrevet her tillader investigator at kvantificere baseline adfærdsmæssige reaktioner eller, formentlig, den overfølsomhed, som indledes efter vævsskade. Hver analyse provokerer forskellige, men beslægtede bevægelsesmæssigt adfærdsmæssige reaktioner på skadelige termiske stimuli og tillader forskeren at visualisere og kvantificere forskellige aspekter af termisk nociception i Drosophila larver. De assays kan anvendes til larver af ønskede genotyper eller larver hævet under forskellige miljøforhold, der kan påvirke nociception. Da termisk nociception er bevaret på tværs af arter, vil resultaterne hentet fra genetisk dissektion i Drosophila sandsynligt informere vores forståelse af termisk nociception i andre arter, herunder hvirveldyr.

Watch this Scientific Journal Video about Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae at JoVE.com

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

I denne artikel, udviser vi analyser for at studere termisk nociception i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver. En analyse involverer rumligt begrænset (lokale) stimulering af termiske nociceptorer<sup&gt; 1,2</sup&gt; Mens den anden omfatter en gros (global) aktivering af de fleste eller alle disse neuroner<sup&gt; 3</sup&gt;. Sammen disse teknikker tillader visualisering og kvantificering af de adfærdsmæssige funktioner<em&gt; Drosophila</em&gt; Nociceptive sensoriske neuroner.

Lokale og globale metoder til vurdering Termisk nociception i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Neuroscience

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

Human Biology

Sensory Systems

SCIENTISTS IN ACTION

Electrophysiological Measurements and Analysis of Nociception in Human Infants

Elektrofysiologiske målinger og analyser af nociception i Human Spædbørn

Pain is an unpleasant sensory and emotional experience. Since infants cannot verbally report their experiences, current methods of pain assessment are ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methods to Assay Drosophila Behavior

Fremgangsmåder til assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering af proprioceptorer i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver og pupper

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associativ olfaktorisk læring i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light Preference Assay til at studere Medfødte og Circadian Reguleret Photobehavior i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Vurdere Neurodegenerative fænotyper i<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminerge neuroner ved at klatre assays og Whole Brain-immunfarvning

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic forstyrrelse af neurale aktivitet med laserbelysning i Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Fouragering Sti-længde Protokol for<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larver

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel analyse for Cold Nociception i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

En temperaturgradient Assay til at fastlægge termisk præferencer af Drosophila larver

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...