Name: local and global methods of assessing thermal nociception in drosophila larvae
Uploaded: 2012-05-18T13:00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae at JoVE.com

Vi takker Christian Landry for varme probe design, Daniel Babcock for utvikling av larvenes varme sonden analysen, Sean Sweeney for å foreslå varmen plate analysen, den Bloomington Drosophila Stock Center for fluefiskere bestander, og Galko lab medlemmer for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 NS069828 til MJG og en NIH MARC U-STAR Training Grant (T34GM079088 til University of Houston-Downtown Scholars Academy) for mindretallet tilgang til forskning karrierer (AVG).

<ol>
	<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li><li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=painless,+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception.">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li><li>Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+thermosensitive+escape+behavior+in+Drosophila+larvae.">A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae.</a> Fly (Austin). 5, 17810 (2011).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons.">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li><li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hamlet,+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology.">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li><li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+regulating+dendritic+outgrowth,+branching,+and+routing+in+Drosophila.">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li><li>Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensive+responses+of+larval+Manduca+sexta+and+their+sensitization+by+noxious+stimuli+in+the+laboratory+and+field.">Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field.</a> J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).</li><li>Woolf, C. J., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptors--noxious+stimulus+detectors.">Nociceptors--noxious stimulus detectors.</a> Neuron. 55, 353-364 (2007).</li><li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li><li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+single+neurons+in+vivo+reveals+specific+roles+of+flamingo+in+neuronal+morphogenesis.">Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).</li><li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction:+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila.">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li><li>Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+silencing+of+Drosophila+pacemaker+neurons+stops+the+free-running+circadian+clock.">Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock.</a> Cell. 109, 485-495 (2002).</li></ol>

Vi har ingenting å avsløre.

Analysene beskrevet her kan brukes til kvalitativt og kvantitativt vurdere larver av ulike genotyper for respons til helsefarlige termiske stimuli. En viktig funksjon i varmen sonden analysen er at stimulus gis bare på et enkelt locus. Dette fører antakelig til avfyring av bare en liten undergruppe av klasse IV nevroner-de i segmentet kontaktet av sonden og kanskje de i umiddelbart tilstøtende segmenter 11. På grunn av den lokale stimulering, etterligner varmen sonden analysen felles sensoriske opplevelsen av å oppdage en skadelig stimulus som er lokalisert til et bestemt organ region, for eksempel en hånd å kontakte en varm ovn. En ulempe med varmen sonden analysen er at det har noen bruker-til-bruker-variasjonen som kan sannsynligvis tilskrives tre forhold: i) trykket som brukeren anvender sonde til larve, ii) den nøyaktige plasseringen av sonden på larve i forhold til de underliggende nociceptive nevroner, og iii) det nøyaktige Angle hvor sonden kontakt med overflaten av larven. Vi tidligere rapporterte en kvantitativ strategi å kategorisere larver i ikke-respondere, langsomme respondere, og raske respondenter basert på deres uttak ventetid til en gitt temperatur ett. Her rapporterer vi på larvenes respons til enda høyere temperaturer. Interessant, finner vi at det er et tak for å larver termiske nociceptive svar og at dette taket ligger mellom 52 og 54 ° C. Dette kan indikere at larvene ikke har en forbigående reseptor potensial (TRP) kanal stand gating ved temperaturer høyere enn 52 ° C. Alternativt kan det tyde på at nervecellene eller muskler som brukes til å initiere eller gjennomføre motorisk respons bli skadet før de kan selv fungere i motvilje tilbaketrekning. Vi rapporterer også en annen analyse av amplituden til uttak respons-hjelp av enten antall ruller som en indikator på &quot;robusthet&quot; av responsen. Naivt, enforventer at disse parametrene ville øke med økende temperatur eller tid på stimulering. Overraskende, finner vi at dette ikke er tilfelle. Larver stimulert for en lengre tid ved en temperatur på den lave enden av skadelige området (42 ° C) viser flere ruller og mer tid brukt rullende enn larver probed ved høyere temperaturer (48-52 ° C). Dette tyder på at innen den skadelige temperaturen vinduet er det først og fremst varigheten av eksponering som bestemmer amplituden av responsen. Siden larver utsettes for svært skadelige temperaturer (48-52 ° C) reagerer på gjennomsnittlig svært raskt, de ikke viser så mange ruller som larver utsettes for en mindre skadelig temperatur for en lengre tidsperiode. Analysen av responsen amplitude rapporteres her tilfører en ny kvantitativ dimensjon langs hvilke ulike genotyper eller miljømessige manipulasjoner kan sammenlignes. En viktig funksjon i varmen plate analysen er at det innebærer en global eksponering mot skadeligevarme. Som sådan er det mer beslektet med dyret sitte i en oppvarming kittel enn berøre en varm ovn. Selv om det er ikke klart når en larve kan oppleve en globalt skadelige stimuli i naturen, i lab de atferdsmessige reaksjoner på dette global eksponering er mer komplekse enn de som ble observert ved lokal stimulering. En styrke på varmen plate analysen, også bemerket av andre 3, er at det har lite bruker-til-bruker-variabilitet siden berøre larven er ikke en del av protokollen. Den eneste betydelige avviket synes å være i definere når hver atferd starter og dette kan minimeres ved gjentatt visning / fortrolighet. En interessant forskjell mellom de analysene er de temperaturene der de aversive atferd begynne. Disse er mye lavere i varmen plate analysen enn med varmen sonde. Den foreløpige oppførsel utstilt av larver kontaktet med varme sonden (hode og hale høyning) kan være en korrelerer av hodet thrash observert på ~ 27 ° C i varmen Plate-analysen. Det er mulig at dette svaret reflekterer &quot;ubehag&quot; mer enn &quot;smerte&quot;. Vi har ikke observert en korrelere med pisking, beslag, og lammelse selv ved høy (opp til 48 ° C) temperaturer i sonden analysen og det kan være at en kritisk masse av sensorisk neuron skyte fra mer enn én region av kroppen er nødvendig for å bringe på disse atferd. Interessant nok er de beslag og lammelser atferd observert ved temperaturer (~ 34 - 37 ° C) under bunnen av nociceptive terskelen observert med varmen sonden indikerer at globalt stimulering kan innebære oppsummering av nevrale responser som er utilstrekkelig til å utløse atferd med lokale anvendelsen av varmen sonde. At disse temperaturene er faktisk oppfattes som skadedyr til larvene er støttet av den observasjon at larver som begynner lammelse atferd, og deretter lov til å utvinne på utlegger mat ikke i de fleste tilfeller overlever (figur 5C). Videre støtter argumentet om at varmen plspiste analysen leser ut nociceptive responser er det faktum at blokkering synaptisk overføring i kjente nociceptive sensoriske nevroner øker ventetiden for de fleste av de observerte atferd (figur 6). Observasjonen om at det er ingen økning i ventetiden for den høyere temperaturen pisking oppførsel tyder på at andre sensoriske nevroner som ikke uttrykker MD-Gal4 kan være nødvendig for denne atferden. I sum, begge analysene innebære å utsette et individ larve til en skadelig termisk stimulans av definerte temperatur - den varme spissen på en liten metall sonde i den lokale analysen og innlevelse i en dråpe raskt varme vann i den globale analysen. Atferdsmessige reaksjoner fra Drosophila larver av varierende genetiske bakgrunn og / eller utsatt for varierende miljøforhold (for eksempel pluss eller minus vevsskade), kan studeres og kvantifiseres ved hjelp av disse prøvene. Til syvende og sist vil resultatene fra disse analysene hjelpe oss å bedre forstå genetiske nettverk styrer NOCiception i Drosophila og andre relaterte arter.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Termisk Probe </td><td> Pro-Dev Engineering </td><td> Custom-built on demand </td><td> Kontaktinformasjon kan leveres på forespørsel </td></tr><tr><td> Tørr Bath Inkubator </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718 </td><td> En solid oppvarming blokk og en oppvarming blokk med 16mm brønner </td></tr><tr><td> Leica DFC290 12v/400mA Fargekamera </td><td> Leica Microsystems </td><td> 12730080 </td><td> Enhver tilsvarende Kameraet vil gjøre. </td></tr><tr><td> Leica MZ6 mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> Delenummer for MZ6 zoom kroppen (optikk transportør) er 10445614 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Ace Modulamp Unit </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Dual Gooseneck 23 tommers Fiberoptisk Lys guide </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> Schott A08575 </td><td></td></tr><tr><td> Termisk kontrollenhet </td><td> TSCI corp. </td><td> Tilpasset bygget </td><td> Detaljer kan gis på forespørsel </td></tr><tr><td> Zeiss STEMI 2000 mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> NT55-605 </td><td> Enhver tilsvarende mikroskopvil gjøre. </td></tr><tr><td> Tang </td><td> FST </td><td> FS-1670 </td><td></td></tr><tr><td> 1mm netting </td><td> Genesee Scientific </td><td> 57-101 </td><td></td></tr><tr><td> Paintbrush </td><td> Dick Blick Kunstmaterialer </td><td> 06762-1002 </td><td></td></tr><tr><td> UV crosslinker </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1199289 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin Krukker </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-816 </td><td></td></tr><tr><td> 10ml begerglass </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540C </td><td></td></tr><tr><td> Dietyleter </td><td> Fisher Scientific </td><td> E138-500 </td><td></td></tr><tr><td> 35 X 10 mm Isopor petriskål </td><td> Falcon </td><td> 351008 </td><td> Vi har ikke testet alternative retter. </td></tr><tr><td> Glass objektglass </td><td> Corning </td><td> 26003 </td><td></td></tr><tr><td> Termoelement </td><td> Omega Engineering, Inc. </td><td> HH802U </td><td></td></tr><tr><td> Piece of vinyl </td><td> Office Depot </td><td> 480009 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrosentrifuge tube </td><td> Denville ScientificInc. </td><td> C-2170 </td><td></td></tr></tbody></table>

local and global methods of assessing thermal nociception in drosophila larvae

I denne artikkelen viser vi analyser for å studere termiske nociception i Drosophila larver. En analysen innebærer romlig-begrenset (lokal) stimulering av termisk nociceptors 1,2 mens den andre innebærer en grossist (global) aktivering av de fleste eller alle slike nevroner 3. Sammen utgjør disse teknikkene tillater visualisering og kvantifisering av de atferdsmessige funksjoner Drosophila nociceptive sensoriske nevroner. Den Drosophila larven er en etablert modell for å studere termiske nociception, en sensorisk respons på potensielt skadelige temperaturer som er evolusjonært bevares over arter 1,2. Fordelene med Drosophila for slike studier er den relative enkelhet av sin nervesystemet og raffinement av de genetiske teknikker som kan brukes til å dissekere den molekylære basisen for den underliggende biologi 4-6 i Drosophila, som i alle metazoans de response til skadelige termiske stimuli innebærer generelt en &quot;nocifensive&quot; motvilje uttak til den framlagte stimulus 7. Slike stimuli oppdages gjennom frie nerveender eller nociceptors og amplitude i organismebiologi responsen avhenger av antall nociceptors mottar skadelige stimulus 8. I Drosophila, er det klasse IV dendrittiske arborization sensoriske nevroner som gjenkjenner skadelige termiske og mekaniske stimuli 9 i tillegg til sin nylig oppdaget rolle som fotoreseptorene 10. Disse nevroner, som har blitt meget godt undersøkt på utviklingsnivå, arborize over barrieren epidermal arket og knytte kontakter med nesten alle epidermale celler 11,12. Singelen axon av hver klasse IV Nevron prosjekter i ventrale nerve ledningen av det sentrale nervesystemet 11 hvor de kan koble seg til andre-ordens nevroner som prosjekt til hjernen. Under baseline forhold, nociceptive sensorisk nevrons vil ikke fyre før en relativt høy terskel er nådd. Analysene som beskrives her tillate undersøkeren å kvantifisere baseline atferdsmessige responser eller formodentlig det sensibilisering som følger følgende vevsskade. Hver analyse provoserer forskjellige, men beslektede motorisk atferdsmessige reaksjoner på skadelige termiske stimuli og tillater forskeren å visualisere og kvantifisere ulike aspekter ved termisk nociception i Drosophila larver. Analysene kan brukes til larver av ønskede genotyper eller larver hevet under ulike miljøforhold som kan påvirke nociception. Siden termisk nociception er konservert over arter, vil funnene sanket fra genetisk disseksjon i Drosophila sannsynlig informere vår forståelse av termisk nociception i andre arter, inkludert virveldyr.

Watch this Scientific Journal Video about Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae at JoVE.com

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

I denne artikkelen viser vi analyser for å studere termiske nociception i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver. En analysen innebærer romlig-begrenset (lokal) stimulering av termiske nociceptors<sup&gt; 1,2</sup&gt; Mens andre innebærer en grossist (global) aktivering av de fleste eller alle slike nevroner<sup&gt; 3</sup&gt;. Sammen utgjør disse teknikkene tillater visualisering og kvantifisering av de atferdsmessige funksjoner<em&gt; Drosophila</em&gt; Nociceptive sensoriske nevroner.

Lokale og globale metoder for å vurdere Thermal Nociception i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Neuroscience

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

Human Biology

Sensory Systems

SCIENTISTS IN ACTION

Electrophysiological Measurements and Analysis of Nociception in Human Infants

Elektrofysiologiske målinger og analyser av Nociception i Human Spedbarn

Pain is an unpleasant sensory and emotional experience. Since infants cannot verbally report their experiences, current methods of pain assessment are ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methods to Assay Drosophila Behavior

Metoder til Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering av Proprioceptors i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver og pupper

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Assosiative Olfactory læring i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Lett preferanse analysen å studere medfødte og Circadian Regulert Photobehavior i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Vurdere nevrodegenerative Fenotyper i<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminerge nevroner ved å klatre Analyser og Whole Brain farging

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic forstyrrelse av nevrale aktiviteten med Laser Illumination i Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Sti lengde Protokoll for<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larver

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel analyse for Cold nociception i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

En temperaturgradient analysen å bestemme termisk preferanser Drosophila larver

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...