Name: local and global methods of assessing thermal nociception in drosophila larvae
Uploaded: 2012-05-18T13:00:00
Duration: 10 min 53 s
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Agradecemos Christian Landry para o calor de design da sonda, Daniel Babcock para o desenvolvimento do ensaio sonda larval calor, Sean Sweeney para sugerindo o ensaio de calor de placas, o Bloomington Drosophila Stock Center para as populações da mosca, e membros Galko laboratório para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 NS069828 para MJG e um NIH MARC U-STAR Training Grant (T34GM079088 para a Universidade de Houston Downtown-Scholars Academy) para o acesso das minorias às carreiras de investigação (AVG).

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	<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li><li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=painless,+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception.">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li><li>Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+thermosensitive+escape+behavior+in+Drosophila+larvae.">A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae.</a> Fly (Austin). 5, 17810 (2011).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons.">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li><li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hamlet,+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology.">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li><li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+regulating+dendritic+outgrowth,+branching,+and+routing+in+Drosophila.">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li><li>Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensive+responses+of+larval+Manduca+sexta+and+their+sensitization+by+noxious+stimuli+in+the+laboratory+and+field.">Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field.</a> J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).</li><li>Woolf, C. J., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptors--noxious+stimulus+detectors.">Nociceptors--noxious stimulus detectors.</a> Neuron. 55, 353-364 (2007).</li><li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li><li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+single+neurons+in+vivo+reveals+specific+roles+of+flamingo+in+neuronal+morphogenesis.">Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).</li><li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction:+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila.">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li><li>Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+silencing+of+Drosophila+pacemaker+neurons+stops+the+free-running+circadian+clock.">Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock.</a> Cell. 109, 485-495 (2002).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Os ensaios aqui descritos podem ser usados ​​para avaliar qualitativamente e quantitativamente as larvas de genótipos diferentes para a capacidade de resposta a estímulos térmicos nocivos. Uma característica principal do ensaio sonda de calor é que o estímulo é dada apenas com um único locus. Este presumivelmente leva à demissão de apenas um pequeno subconjunto de classe IV de neurônios as do segmento contactados pela sonda e, talvez, aqueles que imediatamente segmentos adjacentes 11. Devido à estimulação local, o ensaio de sonda de calor imita a experiência comum sensorial de detecção de um estímulo nocivo que está localizada a uma região do corpo em particular, como uma mão contactando um fogão quente. Uma desvantagem do ensaio sonda de calor é que tem alguma variabilidade utilizador para utilizador que pode provavelmente ser atribuída a três factores: i) a pressão com a qual o utilizador aplica a sonda para a larva, ii) a localização precisa da sonda sobre a larva em relação aos neurónios subjacentes nociceptiva, e iii) o ang precisole em que a sonda contacta com a superfície da larva. Nós relatado anteriormente uma estratégia quantitativa de larvas de categorização em não-respondedores, respondedores e respondedores lentos, rápidos baseados em sua latência de retirada a uma dada temperatura 1. Aqui nós relatamos em resposta larval a temperaturas ainda mais elevadas. Curiosamente, descobrimos que existe um limite máximo para larvais térmicas respostas nociceptivas e que este limite máximo situa-se entre 52 e 54 ° C. Isso pode indicar que as larvas não possuem um potencial receptor transiente (TRP) canais capaz de modular a temperaturas superiores a 52 ° C. Alternativamente, poderia sugerir que os neurônios ou músculos usados ​​para iniciar ou executar a resposta do motor danificado antes mesmo de funcionar na retirada aversivo. Relatamos também uma análise diferente da amplitude da retirada-resposta utilizando-se o número de rolos como um indicador da &quot;robustez&quot; da resposta. Ingenuamente, umaSeria de esperar que estes parâmetros aumentaria com o aumento da temperatura ou do tempo de estimulação. Surpreendentemente, descobrimos que este não é o caso. As larvas estimuladas durante um tempo mais longo a uma temperatura na extremidade baixa da gama nociva (42 ° C) mostram rolos mais e mais tempo gasto de rolamento do que as larvas sondado a temperaturas mais elevadas (48-52 ° C). Isto sugere que dentro da janela de temperatura nocivo é sobretudo a duração da exposição que determina a amplitude da resposta. Uma vez que as larvas expostas a temperaturas altamente nocivo (48-52 ° C) respondem, em média, muito rapidamente, que não apresentem como rolos muitos como larvas exposto a uma temperatura inferior a nociva durante um longo período de tempo. A análise da amplitude da resposta aqui relatados acrescenta uma outra dimensão quantitativa ao longo do qual os diferentes genótipos ou manipulações ambientais podem ser comparados. Uma característica principal do ensaio em placa de calor é que envolve uma exposição global para o nocivocalor. Como tal, é mais parecido com o animal sentado em um caldeirão de aquecimento do que tocar um fogão quente. Embora não seja claro quando uma larva pode experimentar um estímulo nocivo globalmente na natureza, no laboratório as respostas comportamentais a esta exposição global são mais complexos do que aqueles observados com a estimulação local. Uma força de ensaio em placa de calor, também observado por outros 3, é que tem variabilidade utilizador para utilizador pouco desde tocar a larva não é um componente do protocolo. A variância apenas substancial parece ser na definição quando cada comportamento começa e isto pode ser minimizado com visualização repetido / familiaridade. Uma diferença interessante entre os ensaios é as temperaturas às quais os comportamentos aversivos começar. Estes são muito mais baixa no ensaio em placa de calor do que com a sonda de calor. O comportamento preliminar exibido por larvas em contacto com a sonda de calor (cabeça e aumento da cauda) pode estar correlacionado com o thrash cabeça observada a ~ 27 ° C, na plataforma de calorensaio e. É possível que esta resposta reflete &quot;desconforto&quot; mais de &quot;dor&quot;. Nós não observaram uma correlação de chicotear, convulsões, paralisia e mesmo em concentrações elevadas (até 48 ° C), as temperaturas no ensaio de sonda de calor e pode ser que uma massa crítica de neurónio sensorial de queima a partir de mais do que uma região do corpo é necessário para trazer a esses comportamentos. Curiosamente, os comportamentos convulsivos e paralisia são observadas a temperaturas (~ 34 - 37 ° C) abaixo da extremidade inferior do limiar nociceptivo observado com a sonda de calor indicando que a estimulação global pode envolver soma das respostas neuronais que são insuficientes para provocar o comportamento com locais aplicação da sonda de calor. Que estas temperaturas são realmente percebida como nocivo para as larvas é suportada pela observação de que as larvas que começam o comportamento paralisia e são subsequentemente deixados a recuperar em alimentos mosca não na maioria dos casos sobreviver (Figura 5C). Favor da tese de que o pl calorensaio comeu é a leitura de respostas nociceptivas é o facto de que o bloqueio da transmissão sináptica na conhecidos nociceptivos neurónios sensoriais aumenta a latência da maioria dos comportamentos observados (Figura 6). A observação de que não há um aumento na latência para o comportamento temperatura mais elevada-chicotear sugere que outros neurónios sensoriais que não expressam md-Gal4 pode ser necessário para este comportamento. Em suma, ambos os ensaios envolvem expondo uma larva indivíduo a um estímulo nocivo térmica da temperatura definida - a ponta quente de uma sonda de metal pequeno no ensaio de local e de imersão em uma gota de água aquecendo rapidamente no ensaio global. Respostas comportamentais de Drosophila larvas de diferentes origens genéticas e / ou expostos a diferentes condições ambientais (por exemplo mais ou menos danos no tecido), pode ser estudada e quantificada utilizando estes ensaios. Em última análise, os resultados destes ensaios nos ajudará a entender melhor as redes genéticas que controlam nociception em Drosophila e outras espécies relacionadas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Sonda térmica </td><td> Pro-Dev Engenharia </td><td> Custom-construído sob demanda </td><td> As informações de contato podem ser fornecidas a pedido </td></tr><tr><td> Banho seco Incubadora </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718 </td><td> 1 bloco de aquecimento sólida e 1 bloco de aquecimento com poços de 16mm </td></tr><tr><td> Leica DFC290 12v/400mA Câmera colorida </td><td> Leica Microsystems </td><td> 12730080 </td><td> Qualquer equivalente câmara irá fazer. </td></tr><tr><td> Leica MZ6 microscópio </td><td> Leica Microsystems </td><td> Número da peça de corpo MZ6 zoom (portadora óptica) é 10445614 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Ace Unidade Modulamp </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Schott dupla Gooseneck de 23 polegadas de Fibra Óptica Guia de Luz </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> Schott A08575 </td><td></td></tr><tr><td> Unidade de Controle Térmico </td><td> TSCI corp. </td><td> Custom Built </td><td> Detalhes podem ser fornecidas a pedido </td></tr><tr><td> Zeiss Stemi 2000 microscópio </td><td> Zeiss </td><td> NT55-605 </td><td> Qualquer equivalente microscópiovai fazer. </td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> FST </td><td> FS-1670 </td><td></td></tr><tr><td> Um milímetro de malha </td><td> Genesee Científico </td><td> 57-101 </td><td></td></tr><tr><td> Paintbrush </td><td> Dick Blick Materiais de arte </td><td> 06762-1002 </td><td></td></tr><tr><td> Reticulador UV </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1199289 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin Jars </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-816 </td><td></td></tr><tr><td> Copo 10ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540C </td><td></td></tr><tr><td> Éter dietílico </td><td> Fisher Scientific </td><td> E138-500 </td><td></td></tr><tr><td> 35 X 10 mm de poliestireno prato de Petri </td><td> Falcão </td><td> 351008 </td><td> Nós não testamos pratos alternativos. </td></tr><tr><td> Lâmina de vidro </td><td> Corning </td><td> 26003 </td><td></td></tr><tr><td> Termopar </td><td> Omega Engineering, Inc. </td><td> HH802U </td><td></td></tr><tr><td> Pedaço de vinil </td><td> Office Depot </td><td> 480009 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo de microcentrífuga </td><td> Denville CientíficoInc. </td><td> C-2170 </td><td></td></tr></tbody></table>

local and global methods of assessing thermal nociception in drosophila larvae

Neste artigo, demonstramos ensaios para estudar a nocicepção térmica em larvas de Drosophila. Um ensaio envolve a estimulação espacialmente restrita (local) de 1,2 nociceptores térmica, enquanto o segundo envolve uma ativação (global) no atacado da maioria ou todos os neurônios tais 3. Juntas, essas técnicas permitem a visualização e quantificação das funções comportamentais de Drosophila nociceptivas dos neurônios sensitivos. A larva Drosophila é um sistema modelo estabelecido para estudar a nocicepção térmica, uma resposta sensorial para temperaturas potencialmente prejudiciais que é evolutivamente conservada entre espécies 1,2. As vantagens de Drosophila para tais estudos são relativa simplicidade do seu sistema nervoso ea sofisticação das técnicas genéticas que podem ser usados ​​para dissecar a base molecular da biologia subjacente 4-6 Em Drosophila, como em todos os metazoários, os response para estímulos térmicos nocivos geralmente envolve um &quot;nocifensive&quot; retirada aversivo ao estímulo apresentado 7. Tais estímulos são detectados através de terminações nervosas livres ou nociceptores e da amplitude da resposta organismal depende do número de nociceptores que recebem o estímulo nocivo 8. Em Drosophila, são os da classe IV, os neurónios sensoriais dendríticas arborização que detectam nocivas estímulos térmicos e mecânicos 9 em adição ao seu papel recentemente descoberto como fotorreceptores 10. Esses neurônios, que foram muito bem estudadas ao nível de desenvolvimento, arborize sobre a folha de barreira epidérmica e fazer contatos com quase todas as células epidérmicas 11,12. O axônio único de cada classe IV projectos de neurónios na medula ventral do nervo do sistema nervoso central 11, onde eles podem ligar a segunda ordem neurónios que projecto para o cérebro. Em condições basais, neuro sensorial nociceptivans não dispara até um limiar relativamente elevado for atingido. Os ensaios aqui descritos permitem que o investigador para quantificar as respostas comportamentais da linha de base ou, presumivelmente, a sensibilização que se segue danos nos tecidos a seguir. Cada ensaio provoca distintas, porém relacionadas locomotores respostas comportamentais a estímulos térmicos nocivos e permite ao pesquisador visualizar e quantificar diversos aspectos da nocicepção térmica em larvas de Drosophila. Os ensaios podem ser aplicados a larvas de genótipos desejados ou para larvas criadas em diferentes condições ambientais que podem afectar a nocicepção. Uma vez que a nocicepção térmica é conservada entre espécies, os resultados recolhidos a partir de dissecção genética em Drosophila provavelmente informar a nossa compreensão de nocicepção térmica em outras espécies, incluindo vertebrados.

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Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

Neste artigo, demonstramos ensaios para estudar a nocicepção térmica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas. Um ensaio envolve a estimulação espacialmente restrita (local) de nociceptores térmicos<sup&gt; 1,2</sup&gt; Enquanto o segundo envolve uma ativação (global) no atacado da maioria ou todos os neurônios tais<sup&gt; 3</sup&gt;. Juntas, essas técnicas permitem a visualização e quantificação das funções comportamentais de<em&gt; Drosophila</em&gt; Nociceptivas dos neurônios sensitivos.

Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

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