Name: local and global methods of assessing thermal nociception in drosophila larvae
Uploaded: 2012-05-18T13:00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae at JoVE.com

Vi tackar Christian Landry för värme prob design, Daniel Babcock för att utveckla larver analysen värmen sond, Sean Sweeney för att föreslå analysen värmen platta, Bloomington Drosophila Stock Center for flyga bestånd och Galko lab medlemmarna för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av NIH R01 NS069828 att MJG och NIH MARC U-STAR träningsprogram Grant (T34GM079088 till University of Houston-Downtown Scholars Academy) för minoriteternas tillgång till forskarkarriären (AVG).

<ol>
	<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li><li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=painless,+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception.">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li><li>Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+thermosensitive+escape+behavior+in+Drosophila+larvae.">A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae.</a> Fly (Austin). 5, 17810 (2011).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons.">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li><li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hamlet,+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology.">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li><li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+regulating+dendritic+outgrowth,+branching,+and+routing+in+Drosophila.">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li><li>Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensive+responses+of+larval+Manduca+sexta+and+their+sensitization+by+noxious+stimuli+in+the+laboratory+and+field.">Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field.</a> J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).</li><li>Woolf, C. J., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptors--noxious+stimulus+detectors.">Nociceptors--noxious stimulus detectors.</a> Neuron. 55, 353-364 (2007).</li><li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li><li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+single+neurons+in+vivo+reveals+specific+roles+of+flamingo+in+neuronal+morphogenesis.">Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).</li><li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction:+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila.">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li><li>Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+silencing+of+Drosophila+pacemaker+neurons+stops+the+free-running+circadian+clock.">Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock.</a> Cell. 109, 485-495 (2002).</li></ol>

Vi har inget att lämna ut.

Analyserna som beskrivs här kan användas för att kvalitativt och kvantitativt bedöma larver av olika genotyper för lyhördhet för skadliga termiska stimuli. En viktig aspekt av den värme som sonden analysen är att stimulans ges endast vid ett enda ställe. Detta leder sannolikt till bränning av endast en liten undergrupp av klass IV neuroner-de i segmentet i kontakt med sonden och kanske de i omedelbart intilliggande segment 11. På grund av den lokala stimulering, härmar den värme-probanalys den gemensamma sensorisk upplevelse av att detektera en skadlig retning som är lokaliserad till ett visst organ regionen, t.ex. en handen bringa en varm ugn. En nackdel med det värme-probanalys är att det ej har någon användare-till-användare variabilitet som sannolikt kan tillskrivas tre faktorer: i) det tryck med vilket användaren är tillämpligt sonden till larv, ii) det exakta läget för sonden på larven i förhållande till de underliggande nociceptiva neuroner och, iii) den exakta angle, vid vilken sonden i kontakt med ytan hos larven. Vi har tidigare rapporterat en kvantitativ strategi kategorisera larver i icke-responders, långsamma responders och snabba responders baserat på deras tillbakadragande latens till en viss temperatur 1. Här rapporterar vi om larver lyhördhet för ännu högre temperaturer. Intressant, tycker vi att det finns ett tak för larver termiska nociceptiva svar och att detta tak ligger mellan 52 och 54 ° C. Detta kan tyda på att larver inte har en övergående receptor potential (TRP) kanal som kan slussning vid temperaturer högre än 52 ° C. Alternativt kan det tyder på att de nervceller eller muskler som används för att initiera eller utföra motorisk respons skadas innan de ens kan fungera i aversiv tillbakadragande. Vi rapporterar också en annan analys av amplituden för den tillbakadragande respons-användning av antingen antalet rullar som en indikator på den &quot;robusthet&quot; av svaret. Naivt, enskulle förvänta att dessa parametrar skulle öka med ökande temperatur eller tid av stimulering. Överraskande, finner vi att detta inte är fallet. Larver stimulerades under en längre tid vid en temperatur i den lägre delen av den skadliga intervallet (42 ° C) åskådliggör ytterligare rullar och mer tid valsning än larver sonderades vid högre temperaturer (48-52 ° C). Detta antyder att i den skadliga temperaturfönster det primärt är exponeringstiden, som bestämmer amplituden hos responsen. Eftersom larver exponeras för starkt skadliga temperaturer (48-52 ° C) reagera i genomsnitt mycket snabbt, de inte uppvisar så många valsar som larver exponeras för en mindre skadlig temperatur under en längre tidsperiod. Analysen av svaret amplituden redovisas här ger en kvantitativ dimension längs vilken olika genotyper eller miljö manipulationer kan jämföras. En viktig aspekt av den värme som plattan analysen är att det handlar om en global exponering för skadligavärme. Som sådan är det mer liknar djuret sitta i en värme-gryta än att röra en het spis. Även om det är oklart när en larv kan uppleva ett globalt skadlig stimulans i naturen, i labbet beteendemässiga svaren till denna globala exponering är mer komplicerade än de som observerats vid lokal stimulering. En styrka av värmen plattan analysen, också noterat av andra 3, är att den har lite användare till användare variabilitet sedan röra larven inte är en del av protokollet. Den enda betydande variationen verkar vara att definiera när varje beteende inleds och detta kan minimeras med upprepad visning / kännedom. En intressant skillnad mellan analyserna är de temperaturer vid vilka de aversiva beteenden börja. Dessa är mycket lägre i den värme plattanalys än med värme-sonden. Den preliminära beteende som uppvisas av larver i kontakt med det värme-sond (huvud och svans höjning) kan vara en korrelera av huvudet trash observerades vid ~ 27 ° C i värme plate-analys. Det är möjligt att detta svar speglar &quot;obehag&quot; mer än &quot;smärta&quot;. Vi har inte observerat ett nödvändigt korrelat för piska, beslag, och förlamning även vid hög (upp till 48 ° C) temperaturer i värmen sonden analysen och det kan vara att en kritisk massa av sensoriska neuron bränning från mer än en region av kroppen är krävs för att dessa beteenden. Intressant är beslag och förlamning beteenden observerades vid temperaturer (~ 34 till 37 ° C) under den nedre änden av nociceptiv tröskeln observerats med värmen proben indikerar att den globala stimulering kan innebära summering av neuronala svar som är otillräckliga för att utlösa beteendet med lokala applicering av värme sonden. Dessa temperaturer är i själva verket ses som skadliga för larverna stöds av observationen att larverna att påbörja förlamning beteende och därefter fick återhämta på fly livsmedel inte i de flesta fall överleva (figur 5C). Ytterligare stöd för argumentet att värmen PLåt analysen utläsning nociceptiva svaren är det faktum att blockering av synaptisk överföring i kända nociceptiva sensoriska neuroner ökar latensen för de flesta av de observerade beteendena (figur 6). Observationen att det inte finns någon ökning latens för den högre temperatur piska beteende tyder på att andra sensoriska nervceller som inte uttrycker MD-Gal4 kan krävas för detta beteende. Sammanfattningsvis båda analyserna innebär att utsätta en individ larv till en skadlig termisk stimulans definieras temperatur - den heta spetsen av en liten metall sond i den lokala analysen och nedsänkning i en droppe snabbt värma vatten i den globala analysen. Beteendemässiga svaren hos Drosophila larver av varierande genetiska bakgrunder och / eller utsätts för varierande miljöförhållanden (t ex plus eller minus vävnadsskada), kan studeras och kvantifieras med användning av dessa analyser. I slutändan kommer resultatet från dessa analyser att hjälpa oss att bättre förstå genetiska nätverk som styr NOCiception i Drosophila och andra besläktade arter.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Termisk sond </td><td> Pro-Dev Engineering </td><td> Specialbyggt on demand </td><td> Kontaktuppgifter kan lämnas på begäran </td></tr><tr><td> Torr Bath Inkubator </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718 </td><td> 1 fast värmeblock och 1 värmeblock med 16mm brunnar </td></tr><tr><td> Leica DFC290 12v/400mA Färgkamera </td><td> Leica Microsystems </td><td> 12730080 </td><td> Vilket som helst likvärdigt Kameran kommer att göra. </td></tr><tr><td> Leica mikroskop MZ6 </td><td> Leica Microsystems </td><td> Del nummer för MZ6 zooma kroppen (optikhållaren) är 10.445.614 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Ace Modulamp Enhet </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Dual Gooseneck 23-tums fiberoptisk ljusledare </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> Schott A08575 </td><td></td></tr><tr><td> Termisk styrenhet </td><td> TSCI corp. </td><td> Specialbyggd </td><td> Uppgifter får lämnas på begäran </td></tr><tr><td> Zeiss STEMI 2000 mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> NT55-605 </td><td> Vilket som helst likvärdigt mikroskopkommer att göra. </td></tr><tr><td> Tång </td><td> FST </td><td> FS-1670 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mm mesh </td><td> Genesee Scientific </td><td> 57-101 </td><td></td></tr><tr><td> Paintbrush </td><td> Dick Blick Art Materials </td><td> 06762-1002 </td><td></td></tr><tr><td> UV tvärbindningsmedel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1199289 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin Jars </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-816 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml bägare </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540C </td><td></td></tr><tr><td> Dietyleter </td><td> Fisher Scientific </td><td> E138-500 </td><td></td></tr><tr><td> 35 X 10 mm polystyren petriskål </td><td> Falcon </td><td> 351.008 </td><td> Vi har inte testat alternativa rätter. </td></tr><tr><td> Glasmikroskopskiva </td><td> Corning </td><td> 26.003 </td><td></td></tr><tr><td> Termoelement </td><td> Omega Engineering, Inc. </td><td> HH802U </td><td></td></tr><tr><td> Piece of vinyl </td><td> Office Depot </td><td> 480.009 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrocentrifugrör </td><td> Denville ScientificInc. </td><td> C-2170 </td><td></td></tr></tbody></table>

local and global methods of assessing thermal nociception in drosophila larvae

I den här artikeln visar vi analyser för att studera termisk nociception i Drosophila larver. En analys involverar rumsligt begränsad (lokal) stimulering av termisk nociceptorer 1,2 medan den andra innebär en grossist (global) aktivering av de flesta eller alla sådana neuroner 3. Tillsammans utgör dessa tekniker kan visualisering och kvantifiering av de beteendemässiga funktioner Drosophila nociceptiva sensoriska neuroner. Drosophila larv är en etablerad modell för att studera termisk nociception, ett sensoriskt svar till potentiellt skadliga temperaturer som evolutionärt är konserverad mellan arter 1,2. Fördelarna med Drosophila för dessa studier är den relativa enkelheten i dess nervsystem och sofistikerade av de genetiska tekniker som kan användas för att dissekera den molekylära grunden för den underliggande biologin 4-6 i Drosophila, som i alla metazoer de response för att skadliga termiska stimuli innebär i allmänhet en &quot;nocifensive&quot; obehaglig tillbakadragande till den presenterade stimulans 7. Sådana stimuli detekteras genom fria nervändar eller nociceptorer och amplituden hos den organismens respons beror på antalet av nociceptorer mottar skadligt stimulus 8. I Drosophila är det klass IV dendritiska förgrening sensoriska nervceller som upptäcker skadliga termiska och mekaniska stimuli 9 i tillägg till deras nyligen upptäckt roll som fotoreceptorer 10. Dessa nervceller, som har mycket bra studerats på utvecklingsnivå, arborize över barriären epidermal arket och knyta kontakter med nästan alla epidermalceller 11,12. Den enda axon i varje klass IV neuron projekt i den ventrala nerven ur det centrala nervsystemet 11 där de kan ansluta till andra ordningens neuroner som skjuter till hjärnan. Enligt huvudscenariot, nociceptiv sensorisk neurons kommer inte att skjuta förrän en relativt hög tröskel nås. Analyserna som beskrivs här tillåter forskaren att kvantifiera grundläggande beteendemässiga svar eller, förmodligen, sensibilisering som följer efter vävnadsskada. Varje analys framkallar olika men besläktade motoriskt beteende svar på skadliga termiska stimuli och tillåter forskaren att visualisera och kvantifiera olika aspekter av termisk nociception i Drosophila larver. Analyserna kan användas för larver av önskade genotyper eller larver upp under olika miljöförhållanden som kan påverka nociception. Eftersom termisk nociception bevaras över arter kommer resultaten erfarenheter som samlats från genetisk dissektion i Drosophila informera sannolikt vår förståelse av termisk nociception i andra arter, inklusive ryggradsdjur.

Watch this Scientific Journal Video about Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae at JoVE.com

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

I den här artikeln visar vi analyser för att studera termisk nociception i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver. En analys involverar rumsligt begränsad (lokal) stimulering av termiska nociceptorer<sup&gt; 1,2</sup&gt; Medan den andra innebär en grossist (global) aktivering av de flesta eller alla sådana neuroner<sup&gt; 3</sup&gt;. Sammantaget visar dessa tekniker möjliggör visualisering och kvantifiering av de beteendemässiga funktioner<em&gt; Drosophila</em&gt; Nociceptiva sensoriska neuroner.

Lokala och globala Metoder för att bedöma Thermal Nociception i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Neuroscience

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

Human Biology

Sensory Systems

SCIENTISTS IN ACTION

Electrophysiological Measurements and Analysis of Nociception in Human Infants

Elektrofysiologiska mätningar och analyser av nociception i Human Spädbarn

Pain is an unpleasant sensory and emotional experience. Since infants cannot verbally report their experiences, current methods of pain assessment are ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methods to Assay Drosophila Behavior

Metoder för analys Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering av proprioceptorer i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver och puppor

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associativ Olfactory Lärande i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Lätt preferens analys för att studera Innate och Circadian Reglerad Photobehavior i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Uppskatta Neurodegenerativa Fenotyper i<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminerga neuroner genom att klättra Analyser och Helhjärnstänkande immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic störning av neural aktivitet med laserbelysning i Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Födosök Path längd protokoll för<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larver

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel analys för Cold Nociception i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

En temperaturgradient analysen att bestämma termisk preferenser av Drosophila larver

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...