Name: genotyping of plant and animal samples without prior dna purification
Uploaded: 2012-09-24T12:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification at JoVE.com

لعينات ل arabidopsis والمعنية الاشعال PCR نشكر الأستاذ جاكو Kangasjärvi وجماعته، والإجهاد مجموعة نباتية، بيولوجيا النبات، قسم العلوم البيولوجية، جامعة هلسنكي. التجارب كانت تجرى مع الطريقة التقليدية السيدة Airi Lamminmäki. وقدمت عينات الماوس المعدلة وراثيا من قبل الدكتورة جانا Vesterinen، معهد الطب الحيوي / الكيمياء الحيوية، جامعة هلسنكي. هاريس أحادي النواة وقطع بساط هاريس هي علامات تجارية لشركة الاتصالات Shunderson جميع العلامات التجارية الأخرى هي ملك لشركة فيشر العلمية الحرارية والشركات التابعة لها.

<ol>
	<li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).</li><li>Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+isolation+of+high+quality+genomic+DNA+from+fruit+trees+and+conifers+using+PVP.">A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP.</a> Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).</li><li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dCAPS,+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms:+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics.">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).</li><li>Michaels, S. D., Amasino, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+method+for+detecting+single-nucleotide+changes+as+polymorphic+markers+by+PCR.">A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR.</a> The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).</li><li>John, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+RNA+and+DNA+from+plants+containing+polyphenolics.">An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).</li><li>Wang, Z., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+mouse+tails.">Extraction of DNA from mouse tails.</a> BioTechniques. 41, 410-412 (2006).</li><li>Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+High+Molecular+Weight+DNA+for+Reliable+Genotyping+of+Mice.">Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice.</a> BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).</li><li>Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+Leaves+Using+AnyDirect+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory. , (1989).</li><li>Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+sampling+and+extraction+of+mouse+DNA+for+PCR.">Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR.</a> Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).</li></ol>

ويرعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المقالة عن طريق شركة فيشر الحرارية والعلم

النهج PCR المباشر أثبتت هنا لتضخيم PCR يسمح مباشرة من كميات صغيرة من عينات غير منقى، والحد من الوقت اللازم وتبسيط سير العمل لمحطة والتنميط الجيني الحيوانية (الشكل 7). أظهرت أيضا هنا هو استخدام بروتوكول التخفيف في تركيبة مع النهج PCR المباشر (الشكل 3). ويوصى بروتوكول التخفيف مع عينات من الصعب (على سبيل المثال أوراق عمر النبات، والأنواع النباتية التي تحتوي على مركبات التدخل) أو مع amplicons (GC أو الغنية) لفترة طويلة. هذا البروتوكول هو مفيدة بشكل خاص عند بدء التجربة الجديدة PCR مباشرة، مما يسمح لتعظيم الاستفادة من رد الفعل. يمكن للبروتوكول أن تكون بمثابة أداة لمعالجة الصعوبات في بعض الأحيان مثل إنتاجية منخفضة المنتج بسبب الاختلافات في المواد الأنسجة و / أو الاشعال المستخدمة. وعلاوة على ذلك، عند تشغيل ردود فعل متعددة من نفس العينة، واستخدام بروتوكول يضمن التخفيف لا تستهلك كامل العينة في واحدةرد الفعل. وكانت الاتفاقية من أجل تنقية DNA من النباتات لPCR، لأداء تحلل الخلايا تليها عزل الحمض النووي باستخدام المكونات المختلفة التي يمكن أن تتداخل مع تحليل PCR يحتمل 8. لمحطات خاصة مع تحدي محتوى الفينول عالية، إضافة polyvinylpyrrolidone كان يستخدم تقليديا لإزالة المركبات التي ربط DNA بعد تحلل الخلايا 2،5. كما هو واضح هنا، يمكن تجنب هذه معقدة وتستغرق وقتا مكثفة الخطوات من خلال استخدام النباتات Phire كيت PCR المباشرة للكشف عن الحمض النووي المستهدف. ويمكن إهماله تحلل الخلايا والخطوات عزل الحمض النووي باستخدام تقنيات dCAPS الحساسة مباشرة من أوراق نبتة Arabidopsis (الشكل 2). كما هو موضح هنا، وبروتوكول التخفيف تدير بشكل فعال وجود عناصر إشكالية التي يمكن أن تتداخل مع PCR (الشكل 3). تقليديا، كان شرطا أساسيا لالتنميط الجيني الحيواني isolatiعلى من الحمض النووي الجيني من أنسجة الحيوانات السامة من خلال عملية تستغرق وقتا طويلا، تتميز الحضانة مطولة مع K بروتين الجلد لهضم والنسيج الضام، تليها الاستخلاص بالمذيبات العضوية، وهطول الأمطار الكحول، والخطوات الطرد المركزي 6،9،10. كما أظهر هنا، ويتحقق تبسيط هذه العملية من خلال استخدام الأنسجة الحيوانية Phire كيت PCR مباشرة، مما يسمح التنميط الجيني الفئران المعدلة وراثيا دون تنقية DNA السابقة (الشكل 4). المثال موضح في هذه المقالة يمثل تحديا لا سيما فيما كان يستخدم مجموعة واحدة فقط التمهيدي لتضخيم اثنين من شظايا مع اختلاف الحجم الكبير. على الرغم من صعوبة البروتوكول الفطرية، واستخدام نهج PCR المباشر بالتزامن مع بروتوكول تخفيف بسيط أدى إلى عوائد عالية من المنتجات PCR اثنين (الشكل 4). PCR المستندة إلى الكشف عن الحمض النووي المستهدف العديد من التطبيقات في مجال البحوث، بما في ذلك تحليل لتحديد النمط الجينيأدوار الجينات في علم وظائف الأعضاء، وتطوير والمرض. بسبب التسامح المانع للبلمرة DNA المتخصصة، يمكن الانتهاء من البروتوكولات في أقصر وقت ممكن دون تنقية DNA السابقة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> Phire النبات مباشرة PCR كيت </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> F-130 </td><td> 200 ردود الفعل (50 ميكرولتر لكل منهما) </td></tr><tr><td> Phire الحيوانية الأنسجة مباشرة PCR كيت </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> F-140 </td><td> 200 reations (50 ميكرولتر لكل منهما) </td></tr><tr><td> هاريس أحادي الأساسية 0.35 مم (الوردي) </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> F-180S / L </td><td> الكمية: 5/25 </td></tr><tr><td> هاريس أحادي الأساسية 0.50 مم (الأزرق) </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> F-185S / L </td><td> الكمية: 5/25 </td></tr><tr><td> هاريس قطع بساط 6.4 × 7.6 سم </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> F-190 </td><td> الكمية: 5 </td></tr><tr><td> SSPI </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> ER0771 </td><td> 100 ميكرولتر (100 ردود الفعل) </td></tr><tr><td> Piko 24-حسنا الحرارية Cycler </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> 24-PCR لوحات حسنا Piko </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR تنقية كيت </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 محضرات 250 محضرات </td></tr></tbody></table>

genotyping of plant and animal samples without prior dna purification

النهج PCR التضخيم PCR المباشرة يسهل مباشرة من كميات صغيرة من عينات غير منقى، ويتجلى هنا لمحطة عدة والأنسجة الحيوانية (الشكل 1). ويستند مباشرة PCR على تصميم هندسي خاص Phusion العلمية الحرارية وبلمرة DNA Phire، والتي تشمل مجال الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل الملزمة التي يعطيها خصائص فريدة مثل التسامح عالية من مثبطات. PCR المستندة إلى الكشف عن الحمض النووي لديها العديد من التطبيقات المستهدفة في مجال البحوث النباتية، بما في ذلك تحليل الوراثي النباتي والتحقق من جينات منقولة. PCR من الأنسجة النباتية ينطوي عادة على عزل الحمض النووي الأولية الخطوة، والتي قد تتطلب الكواشف باهظة الثمن أو السامة. هذه العملية تستغرق وقتا طويلا ويزيد من مخاطر التلوث عبر 1، 2. وعلى العكس، يمكن باستخدام الحرارية العلمية Phire النبات مباشرة PCR كيت يكون الهدف الكشف عن DNA بسهولة، دون استخراج الحمض النووي قبل. في نموذج أثبت هنا، وهويتم تنفيذ مثال المستمدة المشقوق تضخيم تحليل تسلسل متعدد الأشكال (dCAPS) 3،4 مباشرة من أوراق نبتة Arabidopsis. ويمكن استخدام المقايسات dCAPS التنميط الجيني لتحديد الأشكال المتعددة للتركيبات النووية المنفردة (النيوكلوتايد) من أليل محددة SNP تقييد نوكلياز داخلية الهضم 3. بعض العينات النباتية تميل إلى أن تكون أكثر تحديا عند استخدام أساليب المباشر PCR لأنها تحتوي على المكونات التي تتداخل مع PCR، مثل المركبات الفينولية. في هذه الحالات، يلزم عادة خطوة إضافية لإزالة مركبات 2،5. هنا، يتم التغلب على هذه المشكلة باستخدام بروتوكول التخفيف السريع والسهل PCR التضخيم تليها مباشرة (الشكل 1). وتستخدم خمسة عشر أوراق البلوط عاما نموذجا للتحدي والنباتات العينة تحتوي على كميات عالية من المركبات الفينولية بما في ذلك العفص. ويستخدم على نطاق واسع نقل الجينات في الفئران لدراسة دور الجينات في development، علم وظائف الأعضاء والأمراض التي تصيب البشر. استخدام هذه الحيوانات يتطلب الكشف عن وجود التحوير، وعادة مع PCR. تقليديا، وهذا ينطوي على الوقت العزلة طويلا DNA خطوة خلالها DNA لتحليل PCR يتم تنقيته من أنسجة الأذن والذيل أو أخمص القدمين 6،7. ومع ذلك، يمكن مع العلم الحرارية الأنسجة الحيوانية Phire المباشر الفئران المعدلة وراثيا PCR كيت أن التنميط الجيني DNA دون تنقية السابقة. في هذا التنميط الجيني بروتوكول الماوس المعدلة وراثيا ويتحقق مباشرة من أنسجة الأذن الماوس، كما يتضح هنا للحصول على سبيل المثال صعبة حيث يتم استخدام مجموعة واحدة فقط التمهيدي لتضخيم اثنين من شظايا مختلفة اختلافا كبيرا في الحجم.

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification at JoVE.com

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

النهج PCR المباشرة المقدمة هنا يسهل PCR التضخيم مباشرة من المصنع كميات صغيرة من أنسجة الحيوانات وغير منقى.

التنميط الجيني للعينات النباتية والحيوانية دون تنقية DNA قبل

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Plant Biology

Plant Reproduction

SCIENTISTS IN ACTION

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

تبسيط تنقية DNA البلازميد من ثقافات بروكاريوتيك

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

والطريقة انماط PCR القائم على التمييز بين الأنواع البرية من نوع والزينة لل Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

تنقية انجاس: تسلسل Metagenomes وMetatranscriptomes من مجمع عينات المرتبط الحيوانية

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

الإنتاجية العالية كريسبر ناقل البناء وتوصيف التعديلات الحمض النووي عن طريق توليد جذور الطماطم مشعر

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

تنقية الجينوم على نطاق خارج الصبغي التعميم الحمض النووي من خلايا حقيقية النواة

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

الهجين قطع: طريقة محسنة باجتزاء لعينات الأنسجة النباتية المتمردة

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

مسح بروتوكولات المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لإشكالية النبات، طلائعيات بيضية، وعينات الفطرية

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

عزل الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية من عينات الأنسجة غير المتجانسة المجمدة بدون فرز الخلايا

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...