Name: genotyping of plant and animal samples without prior dna purification
Uploaded: 2012-09-24T12:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification at JoVE.com

Voor de Arabidopsis monsters en de betrokken PCR-primers wij danken Professor Jaakko Kangasjärvi en zijn groep, The Plant Stress Groep, Plant Biology, Department of Biosciences, Universiteit van Helsinki. De experimenten met de traditionele methode werden uitgevoerd door mevrouw Airi Lamminmäki. Transgene muis monsters werden verstrekt door Dr Jaana Vesterinen, Instituut voor medische biologie / biochemie, Universiteit van Helsinki. Harris Uni-Core en Harris snijmat zijn handelsmerken van Shunderson Communications Inc Alle andere handelsmerken zijn het eigendom van Thermo Fisher Scientific Inc en haar dochterondernemingen.

1. Genotypering van Arabidopsis Plant Personen met Direct Protocol <ol><li> De dCAPS genotyperingstest direct in op de Arabidopsis plant blad eerst formuleren 20 of 50 ul PCR reactie met de Phire Plant Direct PCR Kit zoals beschreven in Tabel 1. </li><li> Daarna, snijd een 0,50 mm pons van een Arabidopsis plant blad met behulp van de Harris Uni-Core en Harris snijmat. Houd de puncher stevig, drukt u op de snijkant in het weefsel en draai de puncher heen en weer. </li><li> Druk op de zuiger om de punch disc uit te werpen in een PCR-reactiemengsel. Zorg ervoor dat het monster valt in de PCR-oplossing en plakt niet aan de buis muren. </li><li> Reinig de snijkant van de puncher na elk monster om kruisbesmetting te voorkomen door dompelen in 2% NaClO oplossing. Druk op de zuiger op en neer een paar keer en wrijf de snijkant met een schone papieren handdoek. De snijmat moet ookgespoeld tussen de monsters. </li><li> Vervolgens gebruik van een Thermo Scientific Piko 24-well Thermal Cycler en Thermo Scientific Piko PCR Plate de PCR reacties met de fietsomstandigheden beschreven in tabel 2 uitgevoerd. De PCR reacties kunnen worden uitgevoerd in conventionele PCR thermocyclers. </li><li> Na PCR, spin down het plantmateriaal. Breng 5 ul van het supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis. Voeg 4 pi water en 1 pl restrictie-SspI. Meng voorzichtig en kort draaien tot inhoud op de bodem van de buis. Incubeer het reactiemengsel gedurende een uur bij 37 ° C. Inactiveren het restrictie-enzym door incubatie bij 65 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Wanneer amplificeren DNA rechtstreeks uit plantenweefsel, de PCR producten omvatten planten-en PCR-afgeleide componenten die kunnen interfereren met de restrictiedigestie enzym. Daarom kan het nodig zijn een verdunnen (bijvoorbeeld 1:2 of 1:3 in water) en het PCR product te zuiveren voordat thij daaropvolgende digestie, bijvoorbeeld door een geschikte commerciële kit zoals Thermo Scientific GeneJET PCR Purification Kit. </li><li> Na restrictie-enzym digestie, analyseren de resulterende fragmenten op agarose gel. Voeg 2,5 ul 5x loading buffer aan de reactie en uitvoeren agarose gelelektroforese met 10 ul van het verkregen mengsel. </li></ol> 2. Versterken specifieke DNA-fragmenten van 15-jaar oude Oak Leaves met behulp van het verdunningssysteem Protocol <ol><li> Om te beginnen, snijd een 2 mm punch van eiken blad. </li><li> Plaats het monster in 20 ul van Dilution Buffer geleverd met de Phire Plant Direct PCR Kit. Reinig de snijkant van de puncher en snijmat als voorheen. </li><li> Plet het blad monster met een 100 ul pipet door het kort tegen de buiswand. Afhankelijk van het plantmateriaal, de verdunning protocol werkt soms beter zonder deze te beschadigen het monster. </li><li> Kort draaien de monsters in een microcentrifuge tot tHij reacties zijn op de bodem van buizen. </li><li> Het supernatant kan direct worden gebruikt in de PCR, of kan worden verdund 1:10 of 1:100 in steriel water afhankelijk van het type monster. Gebruik 0,5 pl tot 1 ul van het supernatant of verdunnen als sjabloon voor een 20 pi PCR-reactie. Bereid de reactie als beschreven in tabel 1. </li><li> Zodra de reacties worden bereid, gebruik van een Thermo Scientific Piko 24-well Thermal Cycler en Thermo Scientific Piko PCR Plate de PCR reacties met de fietsomstandigheden beschreven in tabel 2 uitgevoerd. De PCR reacties kunnen worden uitgevoerd in conventionele PCR thermocyclers. </li><li> Na PCR, voeg 5 pl 5x loading buffer aan de reactie en uitvoeren agarose gelelektroforese met 15 pi van het resulterende mengsel. </li></ol> 3. Genotypering van transgene muizen met behulp van het verdunningssysteem Protocol <ol><li> Begin de verdunning protocol over transgene muizen door het plaatsen van een 2 mm punch van de mouse oor in 20 pl Dilution Buffer die 0,5 pi DNARelease Additive geleverd met de Phire Animal Tissue Direct PCR Kit. </li><li> Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 2 min, gevolgd door 2 min incubatie bij 98 ° C. </li><li> Kort draaien de monsters in een microcentrifuge tot de reacties op de bodem van buizen. </li><li> Gebruik 1 pi supernatant als de template voor een PCR reactie 20 pi, bereid zoals beschreven in Tabel 3. Elke supernatant die niet direct worden gebruikt, kan worden overgebracht naar een nieuwe buis en opgeslagen bij -20 ° C. </li><li> Vervolgens gebruik van een Thermo Scientific Piko 24-well Thermal Cycler en Thermo Scientific Piko PCR Plate de PCR reacties met de fietsomstandigheden beschreven in Tabel 4 voeren. Opnieuw kan de PCR reacties worden uitgevoerd in conventionele PCR fietsers. </li><li> Na PCR, voeg 5 pl 5x loading buffer aan de reactie en uitvoeren agarosegelelektroforese wi 15 pi van het resulterende mengsel. </li></ol> 4. Representatieve resultaten In de techniek dCAPS de restrictieplaats in de SNP plaats wordt geïntroduceerd of vernietigd met een PCR primer met een of meer mismatches aan het doel DNA. Genotypering van Arabidopsis planten individuen werd uitgevoerd met de dCAPS techniek direct van blad stoten. De geamplificeerde producten werden geknipt en de resulterende fragmenten waaruit het genotype van elk individu werden geanalyseerd door gelelektroforese (figuur 2). In dit voorbeeld werden de 160 bp PCR producten die de SNP-plaats van belang (G of A allel) in het Arabidopsis genoom geamplificeerd uit plantaardige bladuitsnijdingen de Phire Plant Direct PCR Kit. De voorwaartse primer bevatte een mismatch op het 3&#39;-uiteinde, waardoor een SspI-specifieke restrictieplaats in het doelwit DNA, die de SNP plaats (A allel) maar nietin het andere allel van de SNP (Figuur 2B). Verdunning protocollen nodig zijn voor veeleisende plantmateriaal, zoals eikenblad, vanwege de hoge concentratie van fenolische verbindingen. Met de verdunning hier beschreven protocol werd het 297 bp fragment van chloroplast DNA geamplificeerd met de 3-staps protocol. Eikenblad specimens met verschillende verdunningen zijn weergegeven in figuur 3, naast positieve en negatieve controles. De Phire Animal Tissue Kit Direct PCR werd toegepast met een uitdagende protocol waarin slechts een primer set was voor amplificatie van twee fragmenten gebruikt met een groot formaat voortvloeiende verschil in overvloedige opbrengsten van beide juiste grootte van 1.500 bp producten voor transgene muizen en 200 bp voor wild type muizen (figuur 4). De zwakkere bovenste band met heterozygote muizen door concurrentie van beide templates (allelen) voor hetzelfde primerpaar, maar de genotyping resultaten zijn eenduidig. De stabiliteit van de monsters bereid met de verdunning protocol werd ook getest. De resultaten tonen aan dat de verdunning monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende ten minste een jaar. Bovendien heeft herhaalde vries / dooicycli geen significante invloed op de reactie (Figuur 5). Ook getoond is de sterke amplificatie van muizenoor weefselmonsters met Phire DNA Polymerase en Direct PCR methode ten opzichte van hot start Taq polymerase en gezuiverd DNA (Figuur 6). <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Componenten </td><td fo:width=".75in"> 20 ui reactiemengsel </td><td fo:width=".75in"> 50 ul reactie </td><td fo:width=".75in"> Eindconc. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> In 20 ui </td><td> In 50 ul </td><td></td></tr><tr><td> 2x Phire Plant PCR Buffer </td><td> 10 pi </td><td> 25 pi </td><td> 1x </td></tr><tr><td> primer A </td><td> X pi </td><td> X pi </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> primer B </td><td> X pi </td><td> X pi </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> Phire Hot Start II-DNA-polymerase </td><td> 0,4 pl </td><td> 1 pi </td><td></td></tr><tr><td> Voorbeeld / directe protocol </td><td></td><td> 0,50 mm punch </td><td></td></tr><tr><td> Voorbeeld / verdunning protocol </td><td> 0,5-1 ul </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1.<html> Reactie-omstandigheden voor Plant PCR gebruikt in dit protocol. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Cycle Stap </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Tijd </td><td fo:width=".4in"> Cycli </td></tr><tr><td> Initiële denaturatie </td><td> 98 ° C </td><td> 5 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denaturerende Gloeien * Uitbreiding </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 sec 5 sec 20 sec </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Laatste verlenging </td><td> 72 ° C 4 ° C </td><td> 1 min houden </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Cycling voorwaarden voor Plant PCR gebruikt in dit protocol. * De Tm calculator oposcientific.com / pcrwebtools &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.thermoscientific.com / pcrwebtools wordt aanbevolen het bepalen van de Tm voor primers voor gebruik met Phire Hot Start II DNA Polymerase. de aanbevolen temperatuur voor annealing primers ≤ 20 nt is gelijk aan de lagere Tm die de webtool. primers voor&gt; 20 nt, met een hybridisatietemperatuur 3 ° C lager dan de lagere Tm door de webtool. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Componenten </td><td fo:width=".75in"> 20 ui reactiemengsel </td><td fo:width=".75in"> Eindconc. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> In 20 ui </td><td></td></tr><tr><td> 2x Phire dierlijk weefsel PCR Buffer </td><td> 10 pi </td><td> 1x </td></tr><tr><td> primer A </td><td> X pi </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> primer B </td><td> X pi </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> Phire Hot Start II-DNA-polymerase </td><td> 0,4 pl </td><td></td></tr><tr><td> Voorbeeld / verdunning protocol </td><td> 1 pi </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 3. Reaction voorwaarden voor dierlijk weefsel PCR gebruikt in dit protocol. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Cycle Stap </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Tijd </td><td fo:width=".4in"> Cycli </td></tr><tr><td> Initiële denaturatie </td><td> 98 ° C </td><td> 5 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denaturerende Gloeien * Uitbreiding </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 sec 5 sec 20 sec ≤ 1 kb 20 sec / kb&gt; 1 kb </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Laatste verlenging </td><td>72 ° C 4 ° C </td><td> 1 min Houden </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabel 4. Cycling voorwaarden voor dierlijk weefsel PCR gebruikt in dit protocol. * De Tm rekenmachine <a href="http://www.thermoscientific.com/pcrwebtools" target="_blank">www.thermoscientific.com / pcrwebtools</a> wordt aanbevolen het bepalen van de Tm voor primers voor gebruik met Phire Hot Start II DNA Polymerase. De aanbevolen annealing temperatuur primers ≤ 20 nt is gelijk aan het laagste Tm door de webtool. Voor primers&gt; 20 nt, met een hybridisatietemperatuur 3 ° C lager dan de lagere Tm door de webtool. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Directe PCR workflow. Direct PCR kan worden uitgevoerd met twee alternatieve protocollen. In de directe protocol een kleine hoeveelheid monster wordt direct aan de PCR reactie. De verdunning protocol gebruikt een korte pre-incubatiestap voor PCR om DNA vrij te maken uit het monster. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Genotypering van Arabidopsis planten personen met dCAPS techniek direct van blad stoten. A) Figuur 2A toont het principe van de dCAPS assay uitgevoerd. De restrictieplaats in de SNP plaats wordt geïntroduceerd of verwijderd door PCR met een primer met een of meer mismatches aan het doel DNA. De PCR-producten worden gedigereerd en de resulterende fragmenten blijkt het genotype van elk individu wanneer geanalyseerd door elektroforese. B) 0,50 mm ponsen van bladeren werden direct in 50 pi PCR-reacties. Het 160 bp PCR producten die de SNP-plaats (G of A allel) werden geamplificeerd met primers invoering van een unieke Sspl plaats van de A-allel. Het ongezuiverde PCR producten werden spijsverteringted met Sspl restrictie-enzym. Resulterende fragmenten werden geanalyseerd op een 3% agarose gel. Laan M is de grootte marker, banen A en G corresponderen met de SNP allelen van elk monster. De verkregen resultaten werden bevestigd door conventionele analyse van DNA extractie gevolgd door PCR en restrictiedigestie (data niet getoond). De negatieve controle reacties zonder template DNA werden in testopstelling en uitgevoerd op een aparte agarose gel in parallel met de werkelijke PCR reacties voordat de vertering (data niet getoond). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3.jpg" alt="Figuur 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3highres.jpg" /> Figuur 3. Verdunning protocol met eikenblad. Uit de verdunning protocol werd gebruikt om de 297 bp fragment van chloroplast DNA in eikenblad monsters (3 stappen protocol, annealing bij 62 ° C) amplificeren bij verschillende verdunningen (1:100, 1:10, 1 : 1 en 2:1) en positieve en negatieve controles [C +: positieve controle van gezuiverd DNA (Arabidopsis), C-: negatieve controle zonder template DNA]. Het monster nomenclatuur is de monstername site (steden in Finland) en het monster nummering. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Genotypering van transgene muizen met een primer paar met de verdunning protocol. Ear weefsels van negen individuele muizen (lanen 1-9) werden in 20 ui Dilution Buffer met inbegrip DNARelease Additive. Na incubaties bij kamertemperatuur en 98 ° C, 1 pi supernatant werd gebruikt als een template in de PCR-reactie 20 pl. Fragment maten: 1.500 bp (transgene) en 200 bp (wildtype). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. Monsters bereid volgens de verdunning protocol zijn stabiel voor langdurige opslag. Monsters van muisoor weefsels waren inc<html> ubated in 20 pl Dilution Buffer met inbegrip DNARelease Additieve en onderworpen aan herhaalde bevriezing / ontdooien (laan 1), bewaard bij -20 ° C gedurende een jaar (baan 2), of direct gebruikt voor PCR (laan 3). Het geamplificeerde fragment maten waren 900 bp, 1500 bp en 3200 bp. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig6.jpg" alt="Figuur 6" /> Figuur 6. Phire dierlijk weefsel Direct PCR Kit presteert beter dan een commerciële DNA-zuivering in combinatie met een warme start Taq DNA-polymerase. Vier amplicons (0,5-1,5 kb) werden geamplificeerd uit muisoor weefsels met behulp van de verdunning protocol van Phire dierlijk weefsel Direct PCR Kit. Ter vergelijking werd eerst gezuiverd DNA met een commerciële DNA extraction kit en dezelfde fragmenten werden geamplificeerd met behulp van een hot start Taq DNA polymerase volgens aanbevelingen van de fabrikant. Alleen met de Phire dierlijke weefsel Direct PCR Kit waren alle vier de amplicons met succes versterkt. t &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig7.jpg" alt="Figuur 7" /> Figuur 7. Universele vergelijking van de werkstroom schatting van times / verbruikte reagentia. Thermo Scientific Direct PCR benadering wordt vergeleken met de DNA isolatie benadering de extractiebuffer benadering en de PCR buffer benadering. De geschatte tijd voor elke benadering voor de PCR stap wordt weergegeven in rood. De Thermo Scientific Direct PCR aanpak duurt slechts 0 tot 4 minuten voor de monstervoorbereiding voorafgaand aan de PCR. Onder elke methode worden de verbruikte reagentia genoemd. De Thermo Scientific Direct PCR benadering maakt gebruik van de minste hoeveelheid van de reagentia in vergelijking met de andere methoden. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3844/3844fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> .

<ol>
	<li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).</li><li>Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+isolation+of+high+quality+genomic+DNA+from+fruit+trees+and+conifers+using+PVP.">A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP.</a> Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).</li><li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dCAPS,+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms:+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics.">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).</li><li>Michaels, S. D., Amasino, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+method+for+detecting+single-nucleotide+changes+as+polymorphic+markers+by+PCR.">A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR.</a> The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).</li><li>John, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+RNA+and+DNA+from+plants+containing+polyphenolics.">An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).</li><li>Wang, Z., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+mouse+tails.">Extraction of DNA from mouse tails.</a> BioTechniques. 41, 410-412 (2006).</li><li>Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+High+Molecular+Weight+DNA+for+Reliable+Genotyping+of+Mice.">Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice.</a> BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).</li><li>Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+Leaves+Using+AnyDirect+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory. , (1989).</li><li>Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+sampling+and+extraction+of+mouse+DNA+for+PCR.">Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR.</a> Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).</li></ol>

Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Thermo Fisher Scientific, Inc

De Direct PCR aanpak gedemonstreerd hier zorgt voor PCR-amplificatie rechtstreeks van kleine hoeveelheden ongezuiverde monsters, het verminderen van de tijd die nodig is en vereenvoudiging van de workflow voor plant en dier genotypering (figuur 7). Ook hier blijkt het gebruik van de verdunning protocol in combinatie met de Direct PCR benadering (figuur 3). De verwatering protocol wordt aangeraden met moeilijke monsters (bijvoorbeeld oudere bladeren, planten die bevatten storende verbindingen) of met een lange (of GC-rijke) amplicons. Dit protocol is bijzonder nuttig wanneer een nieuw Direct PCR experiment, waardoor optimalisatie van de reactie. Het protocol kan dienen als middel om soms moeilijkheden zoals lage productopbrengsten door verschillen in weefselmateriaal en / of gebruikte primers pakken. Bovendien wanneer meerdere reacties van hetzelfde monster gebruik van de verdunning protocol zorgt het gehele monster niet verbruikt in eenreactie. Met het oog op DNA te zuiveren van planten voor PCR, de conventie was om cellysis gevolgd door DNA-isolatie met behulp van diverse componenten die zouden kunnen interfereren met PCR-analyse 8 uit te voeren. Voor bijzondere uitdaging planten met hoge fenolische gehalte toevoeging van polyvinylpyrrolidon werd traditioneel gebruikt om de verbindingen die aan DNA binden na cellysis 2,5 verwijderen. Zoals duidelijk hier kunnen deze ingewikkelde, tijdrovende stappen worden vermeden door gebruik van de PCR Phire Plant Direct Kit om het doelwit DNA te detecteren. Cellysis en DNA isolatie stappen overbruggen gevoelige technieken dCAPS direct van Arabidopsis bladeren (figuur 2). Zoals hier aangetoond, de verdunning protocol beheert effectief de aanwezigheid van problematische componenten die kunnen interfereren met PCR (figuur 3). Traditioneel, een voorwaarde voor dier genotypering was isolatiop genomisch DNA van dierlijk weefsel door een giftige, tijdrovend proces gekenmerkt door een langdurige incubatie met proteinase K de huid en bindweefsel, gevolgd door extractie met organisch oplosmiddel, alcohol precipitatie en centrifugatiestappen 6,9,10 verteren. Zoals hier aangetoond worden vereenvoudigd dit proces bereikt door gebruik van de Phire Animal Tissue Direct PCR Kit, waardoor transgene muizen worden gegenotypeerd zonder DNA zuivering (Figuur 4). Het voorbeeld die in dit artikel is bijzonder uitdagend slechts een primer set werd gebruikt voor amplificatie van twee fragmenten met een groot verschil in grootte. Ondanks aangeboren het protocol moeilijkheden gebruik van de PCR Direct benadering in combinatie met de eenvoudige verdunning protocol resulteerde in hoge opbrengsten van de twee PCR producten (figuur 4). PCR gebaseerde detectie target DNA heeft vele toepassingen in onderzoek, inclusief genotype analyse omde rol van genen in de ontwikkeling, fysiologie en ziekte. Door de inhibitor tolerantie van de gespecialiseerde DNA polymerasen, kunnen de protocollen worden voltooid in minimale tijd zonder DNA zuivering.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Phire Plant Direct PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-130 </td><td> 200 reacties (50 pl elk) </td></tr><tr><td> Phire Animal Tissue Direct PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-140 </td><td> 200 zoveel mogelijk te beperken (50 pl elk) </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0,35 mm (roze) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-180S / L </td><td> Aantal: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0,50 mm (blauw) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-185S / L </td><td> Aantal: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Cutting Mat 6,4 × 7,6 cm </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-190 </td><td> Aantal: 5 </td></tr><tr><td> Sspl </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> ER0771 </td><td> 100 pl (100 reacties) </td></tr><tr><td> Piko 24-Well Thermal Cycler </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Well Piko PCR-platen </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR Purification Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 preps 250 preps </td></tr></tbody></table>

genotyping of plant and animal samples without prior dna purification

Direct PCR benadering vergemakkelijkt PCR amplificatie direct van kleine hoeveelheden ongezuiverde monsters, en wordt hier reeds een aantal plantaardige en dierlijke weefsels (figuur 1). Direct PCR is gebaseerd op speciaal ontworpen Thermo Scientific Phusion en Phire DNA polymerasen die een dubbelstrengs DNA bindend domein dat hen unieke eigenschappen zoals hoge tolerantie van remmers omvatten. PCR-gebaseerde doel DNA-detectie heeft tal van toepassingen in plantenonderzoek, met inbegrip van plantaardige genotype analyse en verificatie van transgenen. PCR uit plantenweefsel gaat van oudsher een eerste DNA-isolatie stap, die dure of toxische reagentia. Het proces is tijdrovend en verhoogt het risico op kruisbesmetting 1, 2. Omgekeerd door Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit het doelwit DNA kan gemakkelijk worden gedetecteerd, zonder DNA extractie. In het model aangetoond hier eenvoorbeeld van afgeleide gekloofd versterkt polymorf sequentie analyse (dCAPS) 3,4 gebeurd rechtstreeks van Arabidopsis bladeren van de planten. dCAPS genotyperingsproducten kan worden gebruikt om enkelvoudige nucleotide polymorfismen (SNPs) te identificeren door SNP allel-specifieke restrictie-endonucleasedigestie 3. Sommige gewasmonsters doorgaans moeilijker tijdens directe PCR methoden zoals ze componenten die interfereren met PCR, zoals fenolverbindingen. In deze gevallen wordt een extra stap aan de verbindingen te verwijderen traditioneel vereist 2,5. Hier wordt dit probleem ondervangen door een snelle en eenvoudige verdunning protocol gevolgd door directe PCR-amplificatie (figuur 1). Vijftien jaar oude eiken bladeren worden gebruikt als een model voor uitdagende planten als de als model bevat een hoog gehalte aan fenolische verbindingen met inbegrip van tannines. Gentransfer in muizen is in grote lijnen gebruikt om de rol van genen in ontwik studerenpment, fysiologie en ziekte van de mens. Het gebruik van deze dieren is screening op de aanwezigheid van het transgen, meestal met PCR. Traditioneel betekent dit een tijdrovende DNA isolatiestap, waarbij DNA voor PCR analyse wordt gezuiverd uit het oor, de staart of teen weefsels 6,7. Echter, met de Thermo Scientific Phire dierlijk weefsel Direct PCR Kit transgene muizen worden gegenotypeerd zonder voorafgaande DNA-zuivering. In dit protocol transgene muis genotypering direct verkregen uit muizenoor weefsels, zoals hier aangetoond een uitdagende bijvoorbeeld wanneer slechts een primer set wordt gebruikt voor amplificatie van twee fragmenten verschillen sterk in grootte.

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification at JoVE.com

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

De Direct PCR hier gepresenteerde benadering vergemakkelijkt PCR-amplificatie rechtstreeks van kleine hoeveelheden ongezuiverd planten-en dierlijk weefsel.

Genotypering van plantaardige en dierlijke monsters zonder voorafgaande DNA-zuivering

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Plant Biology

Plant Reproduction

SCIENTISTS IN ACTION

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Gestroomlijnde Zuivering van Plasmide DNA Van Prokaryote culturen

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Een PCR-gebaseerde genotyperingsmethode onderscheid te maken tussen wild-type en Sier Rassen van Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Zuiveren van de Onzuivere: Sequencing metagenomes en Metatranscriptomes van Complex-Animal geassocieerd Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

High-throughput CRISPR Vector Constructie en karakterisering van DNA Wijzigingen van Generation van Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Genoom-brede Zuivering van extrachromosomale circulaire DNA van eukaryote cellen

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Hybride-Cut: een verbeterde Sectioning Methode voor Recalcitrante plantenweefsel Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocollen voor Problematisch Plant, oömyceet en Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Isoleer celtypespecifieke RNA's uit snap-frozen heterogene weefselmonsters zonder celsortering

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...