Name: genotyping of plant and animal samples without prior dna purification
Uploaded: 2012-09-24T12:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification at JoVE.com

לדגימות ארבידופסיס וprimers PCR המודאג אנו מודים פרוף Jaakko Kangasjärvi וקבוצתו, קבוצת לחץ הצמח, ביולוגית צמח, המחלקה לBiosciences, אוניברסיטת הלסינקי. הניסויים עם השיטה המסורתית שנערכו על ידי הגב &#39;Airi Lamminmäki. דגימות עכבר מהונדסות נמסרו על ידי ד&quot;ר יאנה Vesterinen, מכון לביו / ביוכימיה, אוניברסיטת הלסינקי. אריס Uni-Core ומאט חיתוך האריס הם סימנים מסחריים של Shunderson התקשורת בע&quot;מ כל הסימנים המסחריים האחרים הם הרכוש של תרם הפישר סיינטיפיק בע&quot;מ וחברות הבנות שלה.

<ol>
	<li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).</li><li>Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+isolation+of+high+quality+genomic+DNA+from+fruit+trees+and+conifers+using+PVP.">A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP.</a> Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).</li><li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dCAPS,+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms:+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics.">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).</li><li>Michaels, S. D., Amasino, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+method+for+detecting+single-nucleotide+changes+as+polymorphic+markers+by+PCR.">A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR.</a> The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).</li><li>John, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+RNA+and+DNA+from+plants+containing+polyphenolics.">An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).</li><li>Wang, Z., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+mouse+tails.">Extraction of DNA from mouse tails.</a> BioTechniques. 41, 410-412 (2006).</li><li>Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+High+Molecular+Weight+DNA+for+Reliable+Genotyping+of+Mice.">Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice.</a> BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).</li><li>Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+Leaves+Using+AnyDirect+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory. , (1989).</li><li>Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+sampling+and+extraction+of+mouse+DNA+for+PCR.">Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR.</a> Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).</li></ol>

הייצור והגישה חופשיה למאמר זה הוא בחסות תרם פישר סיינטיפיק, Inc

הגישה הישירה PCR הדגימה כאן מאפשרת להגברת PCR ישירות מכמויות קטנות של דגימות unpurified, צמצום הזמן הנדרש ולפשט את זרימת העבודה למפעל וgenotyping בעלי החיים (איור 7). הוכיח גם כאן הוא השימוש בפרוטוקול הדילול בשילוב עם הגישה הישירה PCR (איור 3). פרוטוקול הדילול מומלץ עם דגימות עלים קשות (למשל בגיל צמח, מיני צמחים המכילים תרכובות מפריעות) או עם amplicons הארוך (או GC-עשיר). פרוטוקול זה שימושי במיוחד כאשר מתחיל ניסוי חדש ישיר PCR, המאפשר אופטימיזציה של התגובה. הפרוטוקול יכול לשמש ככלי לטיפול בקשיים מזדמנים כגון תשואות מוצר נמוכות בשל הבדלים בחומר ברקמות ו / או פריימרים המשומשים. יתר על כן, בעת הרצת תגובות מרובות מאותו המדגם, שימוש בפרוטוקול הדילול מבטיח כל המדגם אינו נצרך באחדתגובה. כדי לטהר את ה-DNA מצמחים לPCR, הכנס היה לבצע תמוגה תא אחרי בידוד DNA תוך שימוש ברכיבים שונים שעלולים להפריע לניתוח PCR 8. לצמחים ובמיוחד מאתגרים עם תוכן פנוליות גבוה, תוספת של polyvinylpyrrolidone שמש באופן מסורתי כדי להסיר את התרכובות שנקשרות ל-DNA בעקבות תמוגה תא 2,5. כפי שניתן לראות כאן, ניתן להימנע מפעולות המסובכות האלה, זמן עתירות באמצעות שימוש בצמח Phire הישירה PCR הערכה לזיהוי DNA היעד. תמוגה תא וצעדי בידוד DNA ניתן להשמיט תוך שימוש בטכניקות dCAPS הרגישות ישירות מעלי צמח ארבידופסיס (איור 2). כפי שהודגם כאן, פרוטוקול דילול יעילות מנהל את הנוכחות של מרכיבים בעייתיים שיכול להפריע PCR (איור 3). באופן מסורתי, תנאי מוקדם לבעלי החיים genotyping היה isolatiעל של הדנ&quot;א הגנומי מרקמות בעלי חיים באמצעות תהליך רעיל, זמן רב המאופיינים בדגירה ארוכה עם proteinase K לעכל עור ורקמת חיבור, ואחרי חילוץ ממס אורגני, משקעי אלכוהול, וצעדי צנטריפוגה 6,9,10. כפי שהודגם כאן, פישוט תהליך זה מושג באמצעות שימוש בבעלי חי Phire רקמות הישירות PCR הקיט, המאפשר עכברים הטרנסגניים להיות genotyped ללא טיהור DNA לפני (איור 4). הדוגמא הראתה במאמר זה בעיקר מאתגרת כמו שרק סט אחד פריימר שמש להגברה של שני שברים עם הבדל בגודל גדול. למרות הקושי המולד של הפרוטוקול, שימוש בגישה הישירה PCR בשיתוף עם פרוטוקול הדילול פשוט הביא תשואות גבוהות של שני מוצרי PCR (איור 4). זיהוי DNA יעד PCR מבוסס יש יישומים רבים במחקר, כולל ניתוח גנוטיפ לזהותאת התפקידים של גנים בהתפתחות, פיזיולוגיה ומחלות. בשל סובלנות המעכב של polymerases דנ&quot;א המיוחד, את הפרוטוקולים ניתן להשלים בזמן מינימאלי ללא טיהור DNA מוקדמת.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Phire צמח הישיר PCR Kit </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> F-130 </td><td> 200 תגובות (50 μl כל אחד) </td></tr><tr><td> Phire בעלי חי רקמות הישירה PCR Kit </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> F-140 </td><td> 200 reations (50 μl כל אחד) </td></tr><tr><td> אריס Uni-Core 0.35 מ&quot;מ (ורוד) </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> F-180S / L </td><td> כמות: 5/25 </td></tr><tr><td> אריס Uni-Core 0.50 מ&quot;מ (כחול) </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> F-185S / L </td><td> כמות: 5/25 </td></tr><tr><td> אריס חיתוך Mat 6.4 × 7.6 סנטימטר </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> F-190 </td><td> כמות: 5 </td></tr><tr><td> SSPI </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> ER0771 </td><td> 100 μl (100 תגובות) </td></tr><tr><td> Piko Cycler 24 ובכן התרמית </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> צלחות PCR Piko 24 Well </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR ערכת טיהור </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 preps 250 preps </td></tr></tbody></table>

genotyping of plant and animal samples without prior dna purification

הגישה הישירה PCR מאפשרת הגברת PCR ישירות מכמויות קטנות של דגימות unpurified, והוא הוכיח כאן לכמה צמח ורקמות של חיות (איור 1). הישיר PCR מבוסס על הונדס במיוחד Thermo Scientific polymerases DNA Phire Phusion ו, הכולל תחום מחייב גדילי הדנ&quot;א כפול שנותן להם תכונות ייחודיות כגון סובלנות גבוהה של מעכבים. זיהוי DNA יעד PCR מבוסס יש יישומים רבים במחקר במפעל, כולל ניתוח ובדיקה של transgenes גנוטיפ צמח. PCR מרקמות צמח באופן מסורתי כרוך שלב ראשוני DNA בידוד, שעשוי לדרוש ריאגנטים יקרים או רעילים. התהליך דורש זמן ומגביר את הסיכון לזיהום צולב 1, 2. לעומת זאת, על ידי שימוש Thermo Scientific Phire צמח ישיר PCR ערכת DNA היעד ניתן לאתר בקלות, ללא מיצוי DNA מוקדם. במודל הפגין כאן,דוגמה לניתוח שנגזר בקע מוגבר רב צורות רצף (dCAPS) 3,4 מתבצעת ישירות מעלי הצמח ארבידופסיס. מבחני dCAPS genotyping יכולים לשמש לזיהוי פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודדים (SNPs) על ידי עיכול SNP אלל ספציפי הגבלת endonuclease 3. כמה דוגמאות צמחים נוטות להיות מאתגר יותר בעת שימוש בשיטות PCR ישירות כפי שהם מכילים רכיבים שמפריעים לPCR, כמו תרכובות פנוליות. במקרים אלה, צעד נוסף כדי להסיר את התרכובות נדרש 2,5 באופן מסורתי. כאן, בעיה זו ניתן להתגבר על ידי שימוש בפרוטוקול דילול קל ומהיר ואחרי הגברת PCR ישירה (איור 1). חמש העשרה אלון בן משמשים כמודל עבור צמחים מאתגרים, כדגם מכיל כמויות גבוהות של תרכובות פנוליות כוללים טאנינים. העברת גנים לעכברים משמשת באופן נרחב כדי ללמוד את התפקידים של גנים בdevelopment, פיזיולוגיה ומחלות של בני אדם. השימוש בבעלי החיים אלה מחייב בדיקות לנוכחות של transgene, בדרך כלל עם ה-PCR. באופן מסורתי, זה כרוך בצעד זמן רב DNA בידוד, שבמהלכו DNA לניתוח PCR מטוהר מרקמות אוזן, זנב או בוהן 6,7. עם זאת, עם עכברי Thermo Scientific Phire בעלי חי הרקמות הישירות PCR Kit המהונדסים ניתן genotyped ללא טיהור DNA מוקדמת. בפרוטוקול המהונדס העכבר genotyping זה הושג ישירות מרקמות אוזן עכבר, כפי שמודגם כאן לדוגמה מאתגרת שבו רק סט אחד פריימר משמש להגברה של שני שברים שונים מאוד בגודלו.

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification at JoVE.com

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

הגישה הישירה PCR מוצגת כאן מאפשרת הגברת PCR ישירות מכמויות קטנות של צמח unpurified ורקמות בעלי חיים.

Genotyping של דוגמאות צמחים ובעלי חיים, ללא טיהור DNA לפני

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Plant Biology

Plant Reproduction

SCIENTISTS IN ACTION

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

טיהור יעיל של ה-DNA פלסמיד מתרבויות פרוקריוטים

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

PCR מבוסס genotyping שיטה להבחין בין זנים wild-type ו נוי של Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

טיהור הגנום כולו של DNA המעגל extrachromosomal מתאי איקריוטיים

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

-Cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק הפרוטוקולים (SEM) עבור בעייתי הצמח, Oomycete, וכן דוגמאות פטרייתיים

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

לבודד רנ"א ספציפיים לסוג תא מדגימות רקמות הטרוגניות קפואות ללא מיון תאים

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...