Name: genotyping of plant and animal samples without prior dna purification
Uploaded: 2012-09-24T12:00:00
Duration: 11 min
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Arabidopsis नमूने और संबंधित पीसीआर प्राइमरों के लिए हम प्रोफेसर Jaakko Kangasjärvi और उनके समूह, संयंत्र तनाव समूह, प्लांट बायोलॉजी, बायोसाइंसेज विभाग, हेलसिंकी विश्वविद्यालय धन्यवाद. पारंपरिक विधि के साथ प्रयोगों श्रीमती Airi Lamminmäki द्वारा आयोजित की गई. ट्रांसजेनिक माउस नमूने डा. जान Vesterinen, बायोमेडिसिन / बायोकैमिस्ट्री संस्थान, हेलसिंकी विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किया गया. विश्वविद्यालय कोर हैरिस और हैरिस काटना चटाई Shunderson संचार इंक के ट्रेडमार्क अन्य सभी ट्रेडमार्क थर्मो फिशर साइंटिफिक इंक और इसकी सहायक कंपनियों की संपत्ति हैं.

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	<li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).</li><li>Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+isolation+of+high+quality+genomic+DNA+from+fruit+trees+and+conifers+using+PVP.">A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP.</a> Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).</li><li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dCAPS,+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms:+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics.">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).</li><li>Michaels, S. D., Amasino, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+method+for+detecting+single-nucleotide+changes+as+polymorphic+markers+by+PCR.">A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR.</a> The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).</li><li>John, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+RNA+and+DNA+from+plants+containing+polyphenolics.">An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).</li><li>Wang, Z., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+mouse+tails.">Extraction of DNA from mouse tails.</a> BioTechniques. 41, 410-412 (2006).</li><li>Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+High+Molecular+Weight+DNA+for+Reliable+Genotyping+of+Mice.">Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice.</a> BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).</li><li>Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+Leaves+Using+AnyDirect+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory. , (1989).</li><li>Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+sampling+and+extraction+of+mouse+DNA+for+PCR.">Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR.</a> Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).</li></ol>

उत्पादन और इस लेख के लिए नि: शुल्क प्रवेश थर्मो फिशर साइंटिफिक इंक द्वारा प्रायोजित है

प्रत्यक्ष पीसीआर का प्रदर्शन यहां दृष्टिकोण unpurified नमूनों की छोटी मात्रा से सीधे पीसीआर प्रवर्धन के लिए अनुमति देता है, कम समय की जरूरत है और पौधे और पशु जीनोटाइपिंग (7 चित्रा) के लिए वर्कफ़्लो को सरल बनाने. इसके अलावा यहाँ का प्रदर्शन प्रत्यक्ष पीसीआर दृष्टिकोण (चित्रा 3) के साथ संयोजन में कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल का उपयोग है. कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल मुश्किल नमूने (जैसे आयु वर्ग के संयंत्र पत्ते, संयंत्र प्रजातियों कि हस्तक्षेप यौगिकों होते हैं) के साथ या लंबे समय के amplicons (या जीसी - अमीर) के साथ की सिफारिश की है. इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से उपयोगी है जब एक नया प्रत्यक्ष पीसीआर प्रयोग शुरू, प्रतिक्रिया के अनुकूलन के लिए अनुमति देता है. प्रोटोकॉल एक कम उत्पाद ऊतक सामग्री और / या इस्तेमाल किया प्राइमरों में मतभेद के कारण पैदावार के रूप में कभी कभी कठिनाइयों को संबोधित करने के लिए एक उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं. इसके अलावा, जब एक ही नमूना से कई प्रतिक्रियाओं चल रहे हैं, के कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल का उपयोग सुनिश्चित करता है पूरे नमूना एक में नहीं भस्म हो जाता हैप्रतिक्रिया. आदेश में पीसीआर के लिए पौधों से डीएनए को शुद्ध करने के लिए, सम्मेलन डीएनए अलगाव का उपयोग कर विभिन्न घटकों है कि संभावित पीसीआर 8 विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकता है के द्वारा पीछा करने के लिए सेल lysis प्रदर्शन था. उच्च phenolic सामग्री, polyvinylpyrrolidone के अलावा के साथ विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण संयंत्रों के लिए पारंपरिक यौगिकों कि सेल lysis 2,5 के बाद डीएनए के लिए बाध्य को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. स्पष्ट यहाँ के रूप में, इन जटिल, समय गहन कदम Phire संयंत्र प्रत्यक्ष पीसीआर किट का उपयोग करने के लिए लक्ष्य डीएनए का पता लगाने के माध्यम से बचा जा सकता है. सेल और डीएनए अलगाव कदम Arabidopsis संयंत्र के पत्तों (2 चित्रा) से सीधे संवेदनशील dCAPS तकनीक का उपयोग कर छोड़ा जा सकता है. जैसा कि यहाँ का प्रदर्शन, कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से समस्याग्रस्त घटक है कि पीसीआर (3 चित्रा) के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं की उपस्थिति का प्रबंधन. परंपरागत रूप से, पशु जीनोटाइपिंग के लिए एक शर्त isolatiएक जहरीले, समय लेने वाली त्वचा और संयोजी ऊतक, कार्बनिक विलायक निष्कर्षण, शराब वर्षण की संभावना है, और centrifugation 6,9,10 चरणों का पीछा पचा ​​proteinase कश्मीर के साथ एक लंबी ऊष्मायन द्वारा विशेषता प्रक्रिया के माध्यम से पशु ऊतक से जीनोमिक डीएनए के. यहाँ के रूप में प्रदर्शन किया, इस प्रक्रिया के सरलीकरण Phire पशु ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट के प्रयोग के माध्यम से हासिल की है, ट्रांसजेनिक चूहों पूर्व डीएनए शुद्धि (4 चित्रा) के बिना genotyped करने के लिए अनुमति देता है. इस लेख में प्रदर्शन उदाहरण विशेष रूप से चुनौती दे रहा है, के रूप में केवल एक प्राइमर सेट दो टुकड़े के प्रवर्धन के लिए एक बड़े आकार के अंतर के साथ इस्तेमाल किया गया था. प्रोटोकॉल जन्मजात कठिनाई के बावजूद, के साथ संयोजन के रूप में प्रत्यक्ष पीसीआर दृष्टिकोण सरल कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल दो पीसीआर उत्पादों (4 चित्रा) की उच्च पैदावार में उपयोग करें. पीसीआर आधारित लक्ष्य डीएनए का पता लगाने के अनुसंधान में कई आवेदन किया है जीनोटाइप की पहचान करने के लिए विश्लेषण सहित,विकास, शरीर विज्ञान, और बीमारी में जीन की भूमिका. विशेष डीएनए पीसीआर की अवरोध करनेवाला सहिष्णुता के कारण, प्रोटोकॉल पूर्व डीएनए की शुद्धि के बिना कम से कम समय में पूरा किया जा सकता है.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियां </td></tr><tr><td> Phire संयंत्र प्रत्यक्ष पीसीआर किट </td><td> थर्मो फिशर साइंटिफिक </td><td> F-130 </td><td> प्रतिक्रियाओं 200 (50 μl प्रत्येक) </td></tr><tr><td> Phire पशु ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट </td><td> थर्मो फिशर साइंटिफिक </td><td> F-140 </td><td> 200 reations (50 μl प्रत्येक) </td></tr><tr><td> हैरिस विश्वविद्यालय कोर 0.35 मिमी (गुलाबी) </td><td> थर्मो फिशर साइंटिफिक </td><td> F-180S / एल </td><td> मात्रा: 25 5 / </td></tr><tr><td> हैरिस विश्वविद्यालय कोर 0.50 मिमी (नीला) </td><td> थर्मो फिशर साइंटिफिक </td><td> F-185S / एल </td><td> मात्रा: 25 5 / </td></tr><tr><td> हैरिस चटाई 6.4 × 7.6 सेमी काटना </td><td> थर्मो फिशर साइंटिफिक </td><td> F-190 </td><td> मात्रा: 5 </td></tr><tr><td> SSPI </td><td> थर्मो फिशर साइंटिफिक </td><td> ER0771 </td><td> 100 μl (100 प्रतिक्रियाओं) </td></tr><tr><td> Piko 24-अच्छी तरह से थर्मल cycler </td><td> थर्मो फिशर साइंटिफिक </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> 24 खैर Piko पीसीआर प्लेट्स </td><td> थर्मो फिशर साइंटिफिक </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET पीसीआर शोधन किट </td><td> थर्मो फिशर साइंटिफिक </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 preps 250 preps </td></tr></tbody></table>

genotyping of plant and animal samples without prior dna purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

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Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

प्रत्यक्ष पीसीआर यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण unpurified संयंत्र और पशु ऊतक की छोटी मात्रा से सीधे पीसीआर प्रवर्धन की सुविधा है.

पिछले डीएनए शोधन के बिना संयंत्र और पशु नमूने की जीनोटाइपिंग

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

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