Name: genotyping of plant and animal samples without prior dna purification
Uploaded: 2012-09-24T12:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification at JoVE.com

Per i campioni di Arabidopsis e gli interessati primer PCR ringraziamo il professor Jaakko Kangasjärvi e il suo gruppo, il gruppo lo stress delle piante, Biologia Vegetale, Dipartimento di Bioscienze, Università di Helsinki. Gli esperimenti con il metodo tradizionale sono state condotte dalla signora Airi Lamminmäki. Campioni di topo transgenico sono stati forniti dal Dr. Jaana Vesterinen, Istituto di Biomedicina / Biochimica, Università di Helsinki. Harris Uni-Core e Tappetino da taglio Harris sono marchi di Shunderson Communications Inc. Tutti gli altri marchi sono di proprietà di Thermo Fisher Scientific Inc. e delle sue controllate.

1. Genotipizzazione delle persone pianta di Arabidopsis con protocollo diretto <ol><li> Per iniziare la genotipizzazione dCAPS dosaggio direttamente sulla foglia pianta Arabidopsis, prima formulare 20 o 50 ul reazioni PCR utilizzando l&#39;impianto Phire diretto PCR Kit come descritto in Tabella 1. </li><li> Quindi, tagliare da 0,50 mm da un pugno foglia della pianta Arabidopsis con il Harris Uni-Core e Tappetino da taglio Harris. Tenendo il nemico con forza, premere il all&#39;avanguardia nel tessuto e ruotare il nemico avanti e indietro. </li><li> Premere lo stantuffo per espellere il disco pugno in una miscela di reazione PCR. Assicurarsi che il campione cade nella soluzione di PCR e non aderisce alle pareti del tubo. </li><li> Pulire il bordo tagliente del perforatore tra ciascun campione per evitare la contaminazione incrociata immergendolo in soluzione al 2% NaClO. Premere lo stantuffo su e giù un paio di volte e pulire il bordo di taglio con un tovagliolo di carta pulito. Il tappeto di taglio dovrebbe esseresciacquati tra i campioni. </li><li> Successivamente, impiegano un Thermo Scientific Piko 24 ben Thermal Cycler e Thermo Scientific Piko piastra PCR effettuare le reazioni di PCR utilizzando le condizioni di ciclo descritte nella Tabella 2. Le reazioni di PCR può essere eseguita anche in termociclatori convenzionali PCR termici. </li><li> Dopo la PCR, centrifugare il materiale vegetale. Trasferire 5 ml di surnatante in una nuova provetta. Aggiungere 4 ml di acqua e 1 ml di enzima di restrizione, SspI. Mescolare delicatamente e centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto sul fondo della provetta. Incubare la miscela di reazione per un&#39;ora a 37 ° C. Inattivare l&#39;enzima di restrizione incubando a 65 ° C per 20 min. </li><li> Quando amplificazione del DNA direttamente dai tessuti vegetali, i prodotti di PCR sono componenti di impianti e PCR-derivata che possono interferire con la digestione con enzimi di restrizione. Pertanto, potrebbe essere necessario diluire o (ad esempio 1:2 o 1:3 in acqua) o purificare il prodotto PCR prima tegli digestione successiva, ad esempio utilizzando un apposito kit commerciale come Thermo Scientific Purification Kit GeneJET PCR. </li><li> Seguendo enzimi di restrizione, analizzare i frammenti risultanti su un gel di agarosio. Aggiungere 2,5 ml di tampone di caricamento 5x alla reazione ed eseguire elettroforesi su gel di agarosio con 10 microlitri della miscela risultante. </li></ol> 2. Amplificare frammenti specifici di DNA da Oak 15 anni, lascia utilizzando il protocollo di diluizione <ol><li> Per cominciare, tagliare un pugno 2 mm di foglia di quercia. </li><li> Mettere il campione in 20 ml di tampone di diluizione fornito con il kit di Phire impianto diretto PCR. Pulire la punta di diamante del perforatore e taglio tappetino come prima. </li><li> Macinare il campione in foglia con una punta di 100 microlitri pipetta premendo brevemente contro la parete del tubo. A seconda del materiale vegetale, il protocollo di diluizione volte funziona meglio senza schiacciare il campione. </li><li> Spin i campioni brevemente in una microcentrifuga fino a tegli reazioni sono in fondo dei tubi. </li><li> Il supernatante può essere utilizzato direttamente nel PCR, oppure può essere diluito 1:10 o 1:100 in acqua sterile a seconda del tipo di campione. Usare 0,5 microlitri a 1 microlitri di supernatante o diluizione come modello per una reazione di 20 microlitri PCR. Preparare la reazione, come descritto in Tabella 1. </li><li> Una volta che le reazioni sono preparati, impiegano un Thermo Scientific Piko 24 ben Thermal Cycler e Thermo Scientific Piko piastra PCR effettuare le reazioni di PCR utilizzando le condizioni di ciclo descritte nella Tabella 2. Le reazioni di PCR può essere eseguita anche in termociclatori convenzionali PCR termici. </li><li> Dopo la PCR, aggiungere 5 ml di tampone di caricamento 5x alla reazione ed eseguire elettroforesi su gel di agarosio con 15 microlitri della miscela risultante. </li></ol> 3. Genotipizzazione di topi transgenici che utilizzano il protocollo di diluizione <ol><li> Iniziare il protocollo di diluizione su topi transgenici ponendo un punzone 2 mm del morecchio Ouse in 20 ml di tampone di diluizione contenente 0,5 ml di additivo DNARelease fornito con il tessuto degli animali diretta Kit PCR Phire. </li><li> Incubare i campioni a temperatura ambiente per 2 min, seguito da 2 minuti di incubazione a 98 ° C. </li><li> Centrifugare i campioni brevemente in una microcentrifuga finché le reazioni sono in fondo dei tubi. </li><li> Usare 1 ml di surnatante come modello per una reazione di 20 microlitri PCR, preparato come descritto in Tabella 3. Qualsiasi supernatante che non deve essere utilizzato subito può essere trasferito in una nuova provetta e conservati a -20 ° C. </li><li> Successivamente, impiegano un Thermo Scientific Piko 24 ben Thermal Cycler e Thermo Scientific Piko piastra PCR effettuare le reazioni di PCR utilizzando le condizioni di ciclo descritte in Tabella 4. Ancora una volta, le reazioni di PCR può essere eseguita anche in termociclatori convenzionali PCR. </li><li> Seguendo PCR, aggiungere 5 ml di tampone di caricamento 5x alla reazione ed eseguire l&#39;elettroforesi su gel di agarosio with 15 microlitri della miscela risultante. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Nella tecnica dCAPS il sito di restrizione all&#39;interno del SNP di interesse o è introdotto o distrutto usando un primer PCR con uno o più mismatch al DNA bersaglio. Genotipizzazione di individui pianta di Arabidopsis è stata effettuata con la tecnica dCAPS direttamente dai punzoni foglia. I prodotti amplificati sono stati digeriti ed i frammenti risultanti rivelano il genotipo di ciascun individuo sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel (Figura 2). In questo esempio, i prodotti di PCR 160 bp contenente il sito SNP di interesse (G o A allele) nel genoma Arabidopsis sono stati amplificati dai punzoni pianta a foglia con il Kit Phire impianto diretto PCR. Il primer forward conteneva Uno alla estremità 3 &#39;, creando un SspI specifico sito di restrizione del DNA bersaglio, che comprendeva l&#39;SNP di interesse (allele A) ma nonin altri allele del SNP (Figura 2B). Protocolli di diluizione sono necessari per il materiale vegetale impegnativi, come la foglia di quercia, grazie alla sua elevata concentrazione di composti fenolici. Utilizzando il protocollo di diluizione qui descritto, il frammento di 297 bp di DNA è stato amplificato utilizzando cloroplastica il 3-step protocollo. Campioni foglia di quercia con diluizioni diverse sono mostrati in figura 3, in aggiunta ai controlli positivi e negativi. L&#39;animale Phire Tissue diretto PCR Kit è stato impiegato con un protocollo impegnativo dove è stato usato un solo set di primer per l&#39;amplificazione di due frammenti con una differenza di grandi dimensioni, con conseguente raccolti abbondanti di entrambi i prodotti correttamente dimensionati di 1500 bp per topi transgenici e 200 bp per sorci di tipo selvatico (Figura 4). La fascia più debole superiore con topi eterozigoti è a causa della concorrenza di entrambi i modelli (alleli) per la coppia di primer stesso, tuttavia, la Genotypzione i risultati sono inequivocabili. La stabilità dei campioni preparati utilizzando il protocollo di diluizione è stato anche testato. I risultati mostrano che i campioni di diluizione possono essere conservati a -20 ° C per almeno un anno. Inoltre, i ripetuti cicli gelo / disgelo non ha influenzato significativamente la reazione (Figura 5). È anche illustrato l&#39;amplificazione robusta da campioni di tessuto dell&#39;orecchio di topo usando DNA polimerasi Phire e il metodo diretto PCR rispetto a Taq polimerasi hot start e DNA purificato (Figura 6). <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Componenti </td><td fo:width=".75in"> Reazione di 20 microlitri </td><td fo:width=".75in"> Reazione di 50 microlitri </td><td fo:width=".75in"> Conc. finale. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> Aggiungi a 20 pl </td><td> aggiungere a 50 microlitri </td><td></td></tr><tr><td> 2x Phire Impianto PCR Buffer </td><td> 10 pl </td><td> 25 pl </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A </td><td> X pl </td><td> X pl </td><td> 0,5 micron </td></tr><tr><td> Primer B </td><td> X pl </td><td> X pl </td><td> 0,5 micron </td></tr><tr><td> Phire Hot Start II DNA polimerasi </td><td> 0,4 pl </td><td> 1 ml </td><td></td></tr><tr><td> Campione / Direct Protocol </td><td></td><td> 0,50 millimetri pugno </td><td></td></tr><tr><td> Campione / diluizione protocollo </td><td> 0,5-1 pl </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1.<html> Le condizioni di reazione per PCR pianta utilizzata in questo protocollo. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Fase del ciclo di </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Tempo </td><td fo:width=".4in"> Cicli </td></tr><tr><td> Denaturazione iniziale </td><td> 98 ° C </td><td> 5 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denaturazione Ricottura * Estensione </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 sec 5 sec 20 sec </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Estensione finale </td><td> 72 ° C 4 ° C </td><td> 1 min tenere </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Condizioni bicicletta relativi alle centrali di PCR utilizzato in questo protocollo. * Il calcolatore di Tmoscientific.com / pcrwebtools &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.thermoscientific.com / pcrwebtools è consigliato quando la determinazione del Tm per primer da utilizzare con Phire DNA polimerasi Hot Start II. La temperatura consigliata ricottura per primer ≤ 20 nt è pari a inferiore alla Tm proposta dal WebTool. Per primer&gt; 20 nt, utilizzare una temperatura di ricottura 3 ° C superiore alla Tm inferiore in WebTool. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Componenti </td><td fo:width=".75in"> Reazione di 20 microlitri </td><td fo:width=".75in"> Conc. finale. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> Aggiungi a 20 pl </td><td></td></tr><tr><td> 2x Phire Animal Tissue PCR Buffer </td><td> 10 pl </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A </td><td> X pl </td><td> 0,5 micron </td></tr><tr><td> Primer B </td><td> X pl </td><td> 0,5 micron </td></tr><tr><td> Phire Hot Start II DNA polimerasi </td><td> 0,4 pl </td><td></td></tr><tr><td> Campione / diluizione protocollo </td><td> 1 ml </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3. Condizioni di reazione per PCR tessuti animali utilizzati in questo protocollo. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Fase del ciclo di </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Tempo </td><td fo:width=".4in"> Cicli </td></tr><tr><td> Denaturazione iniziale </td><td> 98 ° C </td><td> 5 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denaturazione Ricottura * Estensione </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 sec 5 sec 20 sec ≤ 1 kb 20 sec / kb&gt; 1 kb </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Estensione finale </td><td>72 ° C 4 ° C </td><td> 1 min Tenere </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabella 4. Condizioni in bicicletta per il tessuto PCR animale utilizzati in questo protocollo. * Il calcolatore Tm a <a href="http://www.thermoscientific.com/pcrwebtools" target="_blank">www.thermoscientific.com / pcrwebtools</a> è consigliato quando la determinazione del Tm per primer da utilizzare con Phire DNA polimerasi Hot Start II. La temperatura consigliata ricottura per primer ≤ 20 nt è pari alla minore Tm in WebTool. Per primer&gt; 20 nt, utilizzare una temperatura di ricottura 3 ° C superiore alla Tm inferiore in WebTool. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. PCR diretta workflow. Diretto PCR può essere effettuata utilizzando due protocolli alternativi. Nel protocollo diretto una piccola quantità di campione viene aggiunto direttamente al PCR reazione. Il protocollo di diluizione impiega una breve fase di pre-incubazione prima della PCR per rilasciare DNA dal materiale campione. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Genotipizzazione di individui di piante di Arabidopsis con tecnica dCAPS direttamente dai punzoni foglia. A) La figura 2A mostra il principio del dosaggio dCAPS eseguita. Il sito di restrizione all&#39;interno del SNP di interesse o è introdotto o rimosso mediante PCR usando un primer con uno o più mismatch al DNA bersaglio. I prodotti di PCR vengono digeriti e i frammenti risultanti rivelano il genotipo di ciascun individuo se analizzato mediante elettroforesi. B) 0.50 punzoni mm a partire da foglie delle piante sono state poste direttamente in 50 pl reazioni PCR. I prodotti di PCR 160 bp contenente il sito SNP (G o A allele) sono state amplificate con primer introdurre un sito unico SspI A-allele. I prodotti PCR erano purificati digestioneta con l&#39;enzima di restrizione SspI. Frammenti risultanti sono stati analizzati su un gel di agarosio al 3%. Corsia M è il marcatore di formato; corsie A e G corrispondono alle alleli SNP di ciascun campione. I risultati ottenuti sono stati confermati mediante analisi convenzionale di estrazione di DNA seguita da PCR e digestione di restrizione (dati non mostrati). Le reazioni di controllo negativo senza DNA stampo sono stati inclusi nella prova impostare ed eseguire su un gel di agarosio separata in parallelo con le reazioni reali PCR prima di eseguire le digestioni (dati non mostrati). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3highres.jpg" /> Figura 3. Protocollo di diluizione usando campioni di foglie di quercia. Il protocollo di diluizione è stato usato per amplificare il frammento di 297 bp di DNA cloroplastica in campioni di foglie di quercia (3-step protocollo, annealing a 62 ° C) a varie diluizioni (1:100, 1:10, 1 : 1 e 2:1) e con positivo e negativotrolli [C +: controllo positivo da DNA purificato (Arabidopsis),-C: controllo negativo senza DNA template]. La nomenclatura campione rappresenta il sito di raccolta del campione (città in Finlandia) e il campione di numerazione. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Genotipizzazione di topi transgenici con una coppia di primer utilizzando il protocollo di diluizione. Tessuti dell&#39;orecchio di nove singoli topi (corsie 1-9) sono stati posti in 20 ml di tampone di diluizione compresi Additivo DNARelease. Dopo incubazione a temperatura ambiente e 98 ° C, 1 ml di surnatante è stato utilizzato come stampo nella reazione di 20 microlitri PCR. Frammento dimensioni: 1,500 bp (transgenici) e 200 bp (tipo selvatico). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Campioni preparati secondo il protocollo di diluizione sono stabili allo stoccaggio a lungo termine. Campioni di tessuti dell&#39;orecchio topo erano inc<html> ubated in 20 pl di tampone di diluizione compresi Additivo DNARelease e sottoposto a ripetuti di congelamento / scongelamento (corsia 1), conservato a -20 ° C per un anno (corsia 2), o usato immediatamente per PCR (corsia 3). Le dimensioni dei frammenti amplificati sono stati 900 bp, 1500 bp e 3200 bp. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Phire Animal Tissue PCR diretta Kit supera un sistema commerciale di purificazione del DNA combinato con un caldo inizio Taq DNA polimerasi. Quattro ampliconi (0,5-1,5 kb) sono stati amplificati da tessuti dell&#39;orecchio del mouse utilizzando il protocollo di diluizione di Animal Tissue Phire Kit Direct PCR. Per confronto, il DNA è stato purificato usando un kit commerciale di estrazione del DNA e gli stessi frammenti sono stati amplificati usando un hot start Taq DNA polimerasi secondo le raccomandazioni del produttore. Solo con l&#39;animale Phire Tissue diretto PCR Kit sono stati tutti e quattro gli ampliconi con successo amplificati. t &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Confronto universale del flusso di lavoro con stima dei tempi / reagenti consumati. Thermo Scientific diretto approccio PCR è rispetto all&#39;approccio isolamento del DNA, l&#39;approccio tampone di estrazione, e l&#39;approccio tampone PCR. Il tempo previsto per ogni approccio prima della fase di PCR è elencato in rosso. Il Thermo Scientific diretto approccio PCR richiede solo 0-4 min per la preparazione del campione prima della PCR. Sotto ogni metodo, i reagenti consumati sono elencati. Il Thermo Scientific diretto approccio PCR utilizza la minor quantità di reagenti rispetto agli altri metodi. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3844/3844fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

<ol>
	<li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).</li><li>Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+isolation+of+high+quality+genomic+DNA+from+fruit+trees+and+conifers+using+PVP.">A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP.</a> Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).</li><li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dCAPS,+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms:+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics.">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).</li><li>Michaels, S. D., Amasino, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+method+for+detecting+single-nucleotide+changes+as+polymorphic+markers+by+PCR.">A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR.</a> The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).</li><li>John, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+RNA+and+DNA+from+plants+containing+polyphenolics.">An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).</li><li>Wang, Z., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+mouse+tails.">Extraction of DNA from mouse tails.</a> BioTechniques. 41, 410-412 (2006).</li><li>Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+High+Molecular+Weight+DNA+for+Reliable+Genotyping+of+Mice.">Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice.</a> BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).</li><li>Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+Leaves+Using+AnyDirect+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory. , (1989).</li><li>Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+sampling+and+extraction+of+mouse+DNA+for+PCR.">Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR.</a> Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).</li></ol>

Produzione e l&#39;accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Thermo Fisher Scientific, Inc.

L&#39;approccio diretto PCR ha dimostrato qui permette l&#39;amplificazione PCR direttamente da piccole quantità di campioni non purificati, riducendo il tempo necessario e la semplificazione del flusso di lavoro per piante e animali genotipizzazione (Figura 7). Dimostrato anche qui è l&#39;uso del protocollo di diluizione in combinazione con l&#39;approccio diretto PCR (Figura 3). Il protocollo di diluizione è raccomandato con campioni difficili (ad esempio foglie delle piante di età, specie di piante che contengono composti interferenti) o lunghi (o GC-ricchi) ampliconi. Questo protocollo è particolarmente utile quando si inizia un nuovo esperimento diretto PCR, consentendo l&#39;ottimizzazione della reazione. Il protocollo può servire come strumento per risolvere le difficoltà occasionali come basse rese di prodotto a causa di differenze di materiale tissutale e / o primer utilizzati. Inoltre, durante l&#39;esecuzione di reazioni multiple dallo stesso campione, l&#39;utilizzo del protocollo di diluizione assicura l&#39;intero campione non è consumata in unoreazione. Per purificare il DNA dalle piante per PCR, la convenzione era effettuare la lisi cellulare seguito da isolamento del DNA utilizzando vari componenti che potrebbero interferire con l&#39;analisi PCR 8. Per impianti particolarmente impegnative, con elevato contenuto fenolico, aggiunta di polivinilpirrolidone è stata tradizionalmente utilizzata per rimuovere i composti che si legano al DNA dopo lisi cellulare 2,5. Come evidente qui, questi complicati e intensità passi possono essere evitati mediante utilizzo dell&#39;impianto Phire diretto PCR Kit per rilevare il DNA bersaglio. Lisi cellulare e la procedura di isolamento del DNA può essere omesso utilizzando le tecniche dCAPS sensibili direttamente da foglie di piante di Arabidopsis (Figura 2). Come dimostrato qui, il protocollo di diluizione gestisce efficacemente la presenza di componenti problematici che possono interferire con PCR (Figura 3). Tradizionalmente, un prerequisito per gli animali genotipizzazione era isolatisu di DNA genomico da tessuti animali attraverso un tossico, lungo processo caratterizzato da una lunga incubazione con proteinasi K per digerire tessuto cutaneo e connettivo, seguita da estrazione con solvente organico, precipitazione alcol, e le fasi di centrifugazione 6,9,10. Come dimostrato qui, la semplificazione di questo processo è realizzato attraverso l&#39;uso del Animal Phire Tissue diretto PCR Kit, permettendo topi transgenici da genotipizzare senza purificazione DNA prima (Figura 4). L&#39;esempio illustrato in questo articolo è particolarmente importante in quanto solo una serie di primer è stata usata per l&#39;amplificazione dei due frammenti con una differenza di grandi dimensioni. Nonostante difficoltà innata del protocollo, l&#39;uso del metodo diretto PCR in combinazione con il protocollo semplice diluizione provocato alte rese dei due prodotti di PCR (Figura 4). PCR-based rilevazione del DNA bersaglio ha molte applicazioni nel campo della ricerca, tra cui analisi del genotipo per identificareil ruolo dei geni nello sviluppo, fisiologia e patologia. A causa della tolleranza inibitore delle DNA polimerasi specializzate, i protocolli possono essere completata in un tempo minimo senza purificazione DNA prima.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Phire Pianta diretto PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-130 </td><td> 200 reazioni (50 microlitri ciascuna) </td></tr><tr><td> Phire Animal Tissue PCR diretta Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-140 </td><td> 200 reations (50 microlitri ciascuno) </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0,35 mm (rosa) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-180S / L </td><td> Qtà: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0.50 mm (blu) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-185S / L </td><td> Qtà: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris taglio Mat 6,4 × 7,6 centimetri </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-190 </td><td> Qtà: 5 </td></tr><tr><td> SspI </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> ER0771 </td><td> 100 pl (100 reazioni) </td></tr><tr><td> Piko 24 Well termociclatore </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> 24 pozzetti Piko Piastre PCR </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR Purification Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 prep 250 prep </td></tr></tbody></table>

genotyping of plant and animal samples without prior dna purification

L&#39;approccio diretto PCR facilita amplificazione PCR direttamente da piccole quantità di campioni non purificati, ed è dimostrata qui per i diversi impianti e tessuti animali (Figura 1). Diretto PCR si basa sulla appositamente progettato Thermo Scientific Phusion e DNA polimerasi Phire, che includono un doppio filamento dominio di legame del DNA che conferisce loro proprietà uniche come alta tolleranza di inibitori. PCR-based rilevazione del DNA di destinazione dispone di numerose applicazioni nella ricerca sulle piante, tra cui l&#39;analisi e la verifica dell&#39;impianto genotipo dei transgeni. PCR dai tessuti vegetali comporta tradizionalmente una prima fase di isolamento del DNA, che può richiedere reagenti costosi o tossici. Il processo richiede tempo e aumenta il rischio di contaminazione incrociata 1, 2. Al contrario, utilizzando Thermo Scientific Phire Pianta diretto PCR Kit DNA bersaglio può essere facilmente rilevato, senza previa estrazione del DNA. Nel modello mostrato qui, unesempio di derivato spaccati analisi di sequenza polimorfico amplificato (dCAPS) 3,4 è effettuata direttamente da foglie delle piante di Arabidopsis. dCAPS saggi di genotipizzazione può essere utilizzato per identificare polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) da SNP allele-specifica digestione con endonucleasi di restrizione 3. Alcuni campioni vegetali tendono ad essere più difficile quando si utilizzano metodi diretti PCR quanto contengono componenti che interferiscono con PCR, come composti fenolici. In questi casi, un ulteriore passaggio per rimuovere i composti è sempre richiesto 2,5. Qui, questo problema viene superato usando un protocollo di diluizione semplice e veloce seguita da Direct amplificazione PCR (Figura 1). Quindici anni foglie di quercia sono utilizzati come modello per le piante impegnative come il campione contiene elevate quantità di composti fenolici tra cui tannini. Trasferimento genico in topi è ampiamente utilizzato per studiare il ruolo dei geni in development, fisiologia e patologia umana. L&#39;uso di questi animali richiede screening per la presenza del transgene, di solito con PCR. Tradizionalmente, questo comporta un dispendio di tempo passo isolamento del DNA, in cui il DNA per l&#39;analisi PCR è purificata da tessuti orecchio, coda o punta 6,7. Tuttavia, con il Thermo Scientific Tissue Phire animali diretti PCR Kit topi transgenici possono essere genotipizzati senza previa purificazione del DNA. In questo protocollo topo transgenico genotipizzazione è ottenuta direttamente da tessuti dell&#39;orecchio topo, come dimostrato qui per un esempio impegnativo dove viene utilizzato un solo set di primer per l&#39;amplificazione di due frammenti di dimensioni notevolmente differenti.

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification at JoVE.com

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

L&#39;approccio qui presentato PCR diretta facilita amplificazione PCR direttamente da piccole quantità di piante non purificato e tessuto animale.

Genotipizzazione di campioni di piante e degli animali, senza purificazione del DNA Prima

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Plant Biology

Plant Reproduction

SCIENTISTS IN ACTION

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Ricerca

Biologia

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Purificazione semplificata del DNA plasmidi da culture procariotiche

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

A PCR-based metodo di genotipizzazione di distinguere tra le varietà selvatiche di tipo ornamentale e di Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Purificare l&#39;Impure: sequenziamento metagenomi e Metatranscriptomes da campioni complessi animali associate

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

High-throughput CRISPR vettore Costruzione e caratterizzazione di modifiche del DNA da Generazione di Roots pomodoro Peloso

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Purificazione genoma a livello di extrachromosomal circolare DNA dalle cellule eucariotiche

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Hybrid-Cut: Un metodo sezionamento migliorato per Recalcitrante tessuti vegetali Campioni

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Microscopia elettronica a scansione (SEM) Protocolli per problematico Plant, oomicete, e campioni fungine

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Isolare RNA specifici del tipo di cellula da campioni di tessuto eterogeneo congelati a scatto senza selezione cellulare

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...