Name: genotyping of plant and animal samples without prior dna purification
Uploaded: 2012-09-24T12:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification at JoVE.com

Для Arabidopsis образцов и соответствующих ПЦР-праймеров, мы благодарим профессора Яакко Kangasjärvi и его группы, группы растений стресс, биологии растений, Департамент биологических наук, Университет Хельсинки. Эксперименты с традиционным методом были проведены миссис Airi Lamminmäki. Трансгенные мыши образцы были предоставлены д-р Яана Vesterinen, Институт биомедицины / биохимии, Университет Хельсинки. Харриса Uni-Core и Харрис резки Мат являются товарными знаками Shunderson связи Все прочие товарные знаки являются собственностью компании Thermo Electron Corporation и ее дочерних компаний.

<ol>
	<li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).</li><li>Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+isolation+of+high+quality+genomic+DNA+from+fruit+trees+and+conifers+using+PVP.">A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP.</a> Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).</li><li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dCAPS,+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms:+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics.">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).</li><li>Michaels, S. D., Amasino, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+method+for+detecting+single-nucleotide+changes+as+polymorphic+markers+by+PCR.">A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR.</a> The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).</li><li>John, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+RNA+and+DNA+from+plants+containing+polyphenolics.">An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).</li><li>Wang, Z., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+mouse+tails.">Extraction of DNA from mouse tails.</a> BioTechniques. 41, 410-412 (2006).</li><li>Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+High+Molecular+Weight+DNA+for+Reliable+Genotyping+of+Mice.">Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice.</a> BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).</li><li>Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+Leaves+Using+AnyDirect+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory. , (1989).</li><li>Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+sampling+and+extraction+of+mouse+DNA+for+PCR.">Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR.</a> Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).</li></ol>

Производство и свободный доступ к этой статье проводится при финансовой поддержке Thermo Fisher Scientific, Inc

Прямой подход ПЦР позволяет продемонстрировали здесь для ПЦР-амплификации непосредственно из небольшого количества неочищенных образцов, сокращения времени, необходимого и упрощения рабочего процесса для растений и животных генотипирования (рис. 7). Также показано здесь является использование протокола разведения в сочетании с прямым подходом ПЦР (рис. 3). Разбавления протокол рекомендуется с трудными образцов (например, возраста листьев растений, виды растений, которые содержат вмешательства соединения) или с длинными (или GC-богатых) ампликонов. Этот протокол является особенно полезной при запуске нового прямого эксперимента ПЦР, позволяющая для оптимизации реакции. Протокол может служить в качестве инструмента для решения случайные трудности, такие как низкий выход продукта из-за различий в материале ткани и / или праймеров. Кроме того, при работе с несколькими реакции со стороны того же образца, использовать для разбавления протокол обеспечивает весь образец не потребляется в одномреакции. Для очистки ДНК из растений для ПЦР, конвенция призвана выполнять лизиса клеток следуют выделения ДНК с использованием различных компонентов, которые потенциально могут мешать ПЦР-анализа 8. Для особо сложных растений с высоким содержанием фенольных, добавлением поливинилпирролидона традиционно используется для удаления соединений, которые связываются с ДНК после лизиса клеток 2,5. Как видно здесь, это сложное, время интенсивного шага можно избежать за счет использования заводе Phire Прямая PCR Kit для обнаружения ДНК-мишени. Лизис клеток и шаги выделения ДНК могут быть опущены помощью чувствительных методов dCAPS непосредственно из Arabidopsis листьев растений (рис. 2). Как показано здесь, разведение Протокол эффективно управляет наличие проблемных компонентов, которые могут мешать ПЦР (рис. 3). Традиционно, необходимым условием для животных генотипирования было isolatiна геномной ДНК из тканей животных посредством токсичных, отнимающий много времени процесс характеризуется длительной инкубации с протеиназы К переварить кожи и соединительной ткани, после экстракции органическим растворителем, алкоголь осадков, и центрифугирования шаги 6,9,10. Как показано здесь, упрощения этого процесса достигается за счет использования животного Phire ткани прямой PCR Kit, позволяющий трансгенных мышей для генотипировали без предварительной очистки ДНК (рис. 4). Например продемонстрировал в этой статье, особенно трудно, так как только один набор праймеров были использованы для усиления двух фрагментов с большой разницей размеров. Несмотря на врожденную сложность протокола, использование прямого подхода ПЦР в сочетании с простой протокол разведения в результате высоких урожаев двух продуктов ПЦР (рис. 4). ПЦР-ДНК-мишени обнаружения имеет множество применений в исследованиях, включая генотип анализ для выявленияРоль генов в развитии, физиологии и болезней. В связи с ингибитором толерантности специализированных ДНК-полимеразы, протоколы могут быть завершены в минимальные сроки без предварительной очистки ДНК.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Phire завод Прямая PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-130 </td><td> 200 реакций (50 мкл) </td></tr><tr><td> Phire тканей животных Прямые PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-140 </td><td> 200 reations (50 мкл) </td></tr><tr><td> Харриса Uni-Core 0,35 мм (розовый) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-180S / L </td><td> Кол-во: 5/25 </td></tr><tr><td> Харриса Uni-Core 0,50 мм (синяя) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-185S / L </td><td> Кол-во: 5/25 </td></tr><tr><td> Харрис резки Мат 6,4 × 7,6 см </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-190 </td><td> Кол-во: 5 </td></tr><tr><td> SspI </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> ER0771 </td><td> 100 мкл (100 реакций) </td></tr><tr><td> Piko 24-Ну Термоциклер </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Ну Piko ПЦР ​​Планшеты </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR Очистка Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 Preps 250 Preps </td></tr></tbody></table>

genotyping of plant and animal samples without prior dna purification

Прямой подход облегчает ПЦР ПЦР-амплификации непосредственно из небольшого количества неочищенных образцов, и демонстрирует здесь в течение нескольких растительных и животных тканях (рис. 1). Прямая ПЦР основан на специально оборудованных Thermo Scientific Phusion и полимераз Phire ДНК, которые включают в себя двухцепочечной ДНК-связывающий домен, который дает им уникальные свойства, такие как высокая устойчивость ингибиторов. ПЦР-ДНК-мишени обнаружения имеет многочисленные приложения в растительных исследования, включая анализ генотипа растения и проверки трансгенов. ПЦР из тканей растений, традиционно включает в себя начальный этап выделения ДНК, что может потребовать дорогих или токсичных реагентов. Этот процесс занимает много времени и увеличивает риск перекрестного загрязнения 1, 2. Напротив, при использовании Thermo Scientific Phire завод Прямая PCR Kit целевой ДНК могут быть легко обнаружены, без предварительного выделения ДНК. В модели показано здесь,Например производных дрова амплификации полиморфной анализ последовательности (dCAPS) 3,4 производится непосредственно из Arabidopsis листья растений. dCAPS генотипирования анализы могут быть использованы для идентификации одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) по SNP аллель-специфической эндонуклеазы рестрикции пищеварения 3. Некоторые образцы растений, как правило, более сложной при использовании прямого метода ПЦР, так как они содержат компоненты, которые мешают ПЦР, таких как фенольные соединения. В этих случаях дополнительные шаги для удаления соединений традиционно требуется 2,5. Здесь эта проблема преодолевается с помощью быстрого и легкого разведения протокола следует Прямая ПЦР-амплификации (рис. 1). Пятнадцать лет дубовых листьев используется в качестве модели для сложных растений, как образец содержит большое количество фенольных соединений, в том числе дубильные вещества. Перенос генов в организм мышей широко используется для изучения роли генов в развитвремя транспортировки, физиологии и болезни человека. Использование этих животных требует обследования на наличие трансгенов, как правило, с ПЦР. Традиционно, это связано с трудоемким шагом выделения ДНК, в которой ДНК для анализа ПЦР очищали от уха, хвост или ноги тканей 6,7. Однако, с Thermo Scientific Phire тканей животных Прямые PCR Kit трансгенных мышей может быть генотипировали без предварительной очистки ДНК. В этом протоколе трансгенных мышей генотипа осуществляется непосредственно из тканей уха мыши, как показано здесь сложный пример, где только один набор праймеров используются для усиления двух фрагментов различной значительно в размерах.

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification at JoVE.com

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Прямой подход ПЦР, представленные здесь облегчает ПЦР-амплификации непосредственно из небольшого количества неочищенных растительных и животных тканях.

Генотипирование растений и животных образцов без предварительного очистки ДНК

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Plant Biology

Plant Reproduction

SCIENTISTS IN ACTION

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Упрощенная очистка плазмидной ДНК из Прокариотические культур

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

ПЦР-метод генотипирования различать дикого типа и декоративных многообразия Императы цилиндрической</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Очищение нечистых: секвенирование метагеномов и Metatranscriptomes от сложных образцов животного связано

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplification, следующего поколения Секвенирование и геномную ДНК Mapping ретровирусных интеграции сайты

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Высокая пропускная способность CRISPR Конструирование вектора и характеристика ДНК Модификации генерацией Томатный волосистых корней

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Генома Очистка экстрахромосомального кольцевой ДНК из эукариотических клеток

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Гибрид-Cut: улучшенный Секционирование Метод непокорных растительных образцов тканей

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Сканирующей электронной микроскопии (SEM) Протоколы для Проблемной завода, оомицет и грибковые Образцы

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Выделение специфических для клеток РНК из замороженных образцов гетерогенных тканей без сортировки клеток

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...