Name: candida albicans biofilm chip (cabchip) for high-throughput antifungal drug screening
Uploaded: 2012-07-18T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato in parte da finanziamenti della Texas South Management Technology (POCrr 2009,041), l&#39;Istituto per l&#39;integrazione di Medicina e Scienza dal Centro Risorse Nazionale per la Ricerca (UL 1RR025767), e dal National Institute of Dental Research &amp; craniofacciale ( 5R21DE017294).

1. Preparazione dei vetrini funzionalizzati <ol><li> Collocare i vetrini in un rack scorrevole estraibile, e lavare due volte immergendolo in una vaschetta di colorazione contenente 99% di etanolo (grado istologico). Pulire le diapositive pulire con tovaglioli di carta (assicurando di non generare polvere di carta), e asciugare con un getto di gas azoto compresso. </li></ol> NOTA: non utilizzare Kim-Wipes per pulire le diapositive in quanto genererebbe polveri sottili di carta....

<ol>
	<li>Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+United+States+hospitals:+a+three-year+analysis.">Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis.</a> Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).</li><li>Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+multidrug+efflux+pumps+in+relation+to+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans+biofilms.">Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms.</a> J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).</li><li>Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Throughput+Candida+albicans+Biofilm+Chip.">Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip.</a> PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li><li>Pierce, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reproducible+96-well+plate-based+method+for+the+formation+of+fungal+biofilms+and+its+application+to+antifungal+susceptibility+testing.">A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing.</a> Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).</li><li>Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+microarray+for+high-throughput+toxicology+assays.">Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).</li><li>Meyerhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+resist+films+produced+by+spinning.">Characteristics of resist films produced by spinning.</a> Journal of Applied Physics. 49, (1978).</li><li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms.">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li><li>Chandra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans:+Development,+architecture,+and+drug+resistance.">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li><li>Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biofilms+and+drug+resistance.">Fungal biofilms and drug resistance.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).</li><li>Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+activity+of+amphotericin+B,+caspofungin+and+posaconazole+on+Candida+albicans+biofilms+in+intermediate+and+mature+development+phases.">Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases.</a> Mycoses. 53, 208-214 (2010).</li></ol>

Abbiamo sviluppato un cell-based ad alta densità microarray, Ca BChip, costituito da volumi nanolitri biofilm di Candida albicans. Il microarray è stata stampata su substrati di vetro modificato, che ha consentito per il fissaggio solido di spot gel di collagene, fornendo idrofobicità necessaria per un non-diffusione, gel emisferica 3D. Un singolo Ca BChip può sostituire circa otto piastre a 96 pozzetti, e chip diversi possono essere stampati e trattati allo stesso tempo. Il chip utilizza ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 3-amminopropiltrietossisilano (APTES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 440140 </td></tr><tr><td> Polistirene-Co-anidride maleica (PS-MA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 426946 </td></tr><tr><td> Microscopia diapositive di vetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549-3 </td></tr><tr><td> Coda di tipo Rat collagene I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Robotic micro-distributore </td><td> Omnigrid Micro </td><td> MICROSYS4000/4100A </td></tr><tr><td> Microarray Scanner </td><td> GenePix Personal 4100A </td><td> GENEPIX4100A </td></tr><tr><td> Ibridazione Cassette </td><td> ArrayIt Corporation </td><td> AHCXD </td></tr><tr><td> FUN1 [2-clororo-4-(2,3-diidro-3-metil-(benzo -1,3-tiazol-2-il)-metilidene)-1-fenil quinoliniumiodide] </td><td> Invitrogen Corp. </td><td> F-7030 </td></tr><tr><td> Fluconazolo </td><td> Sicor Pharmaceuticals, Inc. </td><td> J02AC01 </td></tr><tr><td> Amfotericina B </td><td> Sigma </td><td> A2411 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 50-020-PC </td></tr><tr><td> Ceramic Tip 190 micron orifizio </td><td> Digilab </td><td> 60020441-00 </td></tr><tr><td> GraphPad Prism Software </td><td> GraphPad Software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> GenePix Pro V4.1 </td><td> Molecular Devices </td><td></td></tr></tbody></table>

candida albicans biofilm chip (cabchip) for high-throughput antifungal drug screening

Candida albicans rimane il principale agente eziologico della candidosi, che attualmente rappresenta la quarta più comune infezione nosocomiale sangue negli ospedali degli Stati Uniti 1. Queste infezioni opportunistiche rappresentano una crescente minaccia per un numero crescente di individui compromessi, e portare i tassi di mortalità eccessivamente elevati. Ciò è in parte dovuto al limitato arsenale di farmaci antifungini, ma anche alla comparsa di resistenza agli agenti antifungini più comunemente usati. A complicare ulteriormente trattamento è il fatto che una maggioranza di manifestazioni di candidosi sono associati con la formazione di biofilm, e le cellule all&#39;interno di questi biofilm mostrano livelli aumentati di resistenza agli clinicamente più utilizzati agenti antifungini 2. Qui si descrive lo sviluppo di una alta densità microarray che consiste di C. albicans nano-biofilm, che abbiamo chiamato Ca BChip 3. Brevemente, un micro-distributore robotico viene utilizzato to lievito cellule stampa di C. albicans su una substrato solido. Durante la stampa, le cellule di lievito sono racchiusi in una matrice tridimensionale usando un volume basso quanto 50 nL e immobilizzato su un substrato di vetro con un idoneo rivestimento. Dopo la stampa iniziale, le diapositive vengono incubate a 37 ° C per 24 ore per consentire per sviluppo biofilm. Durante questo periodo le macchie crescere in pienamente sviluppati &quot;nano-biofilm&quot; che visualizzare tipici caratteristiche strutturali e fenotipica associati con mature C. albicans biofilm (complessità vale a dire morfologica, tre l&#39;architettura dimensionale e resistenza ai farmaci) 4. Complessivamente, il BChip Ca è composto di ~ 750 biofilm equivalenti e spazialmente distinto; con il vantaggio supplementari che chip multipli può essere stampato e elaborati contemporaneamente. La vitalità cellulare è stimato misurando l&#39;intensità fluorescente di FUN1 metabolica macchia utilizzando un scanner microarray. Questo chip fungina è l&#39;ideale per use in vero high-throughput screening per la scoperta di nuovi farmaci antifungini. Rispetto agli standard attuali (cioè il 96-well modello piastra microtitolo della formazione di biofilm 5), i principali vantaggi del chip biofilm fungine sono automazione, miniaturizzazione, risparmi nei costi e quantità dei reagenti e dei tempi di analisi, nonché l&#39;eliminazione di lavoro operazioni intensive. Noi crediamo che il chip in modo significativo ad accelerare il processo di scoperta di nuovi farmaci antifungini.

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Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Abbiamo sviluppato una piattaforma ad alta densità microarray costituito da nano-3D di biofilm<em&gt; C. albicans</em&gt; Chiamato<em&gt; Ca</em&gt; BChip. Il profilo suscettibilità di farmaci testati su una<em&gt; Ca</em&gt; BChip è paragonabile a quello tradizionale a 96 pozzetti modello di piastra, suggerendo che il chip funghi è ideale per una vera high-throughput screening di farmaci antifungini.

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) per High-throughput screening farmaco antifungino

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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