Name: a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels
Uploaded: 2012-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de US Public Health Service Award NS-071530.

1. Voorbereiding van de Cellen <ol><li> Groei hypofyse AtT20 cellen in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) aangevuld met 10% paardenserum en handhaven culturen 37 ° C in een vochtige atmosfeer van 5% CO2. </li><li> Handhaving van de cultuur door een subcultuur van de cellen om de 5 tot 7 dagen met een standaard behandeling met trypsine procedure. </li><li> Smeer de putjes zwart, duidelijke bottom 96-wells platen met 50 ul van poly-L-lysine. Laat de putten drogen gedurende 30 min in de in...

<ol>
	<li>Hibino, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifying+potassium+channels:+their+structure,+function+and+physiological+roles.">Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles.</a> Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).</li><li>Lusscher, C., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+for+G+protein-gated+inwardly+rectifying+potassium+(GIRK)+channels+in+health+and+disease.">Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).</li><li>Kobayashi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-activated+inwardly+rectifying+potassium+channels+as+potential+therapeutic+targets.">G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets.</a> Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).</li><li>Terstappen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+native+and+recombinant+ion+channels+using+a+high-capacity+nonradioactive+rubidium+efflux+assay.">Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay.</a> Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).</li><li>Cheng, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+HERG+potassium+channel+function+assay:+an+old+assay+with+a+new+look.">A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).</li><li>Zhang, J. -. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochem. 37, 13291-13299 (1998).</li><li>Inomata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-arrhythmic+agents+act+differently+on+the+activation+phase+of+the+Ach-response+in+guinea+pig+atrial+myocytes.">Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).</li><li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+high+throughput+functional+assay+methods+for+HERG+potassium+channel.">Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel.</a> J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).</li><li>Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+membrane+potential-sensitive+fluorescent+probes+and+their+use+in+ion+channel+screening+assays.">Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).</li><li>Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).</li><li>Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+Ether-&#225;-go-go+related+gene+screening+assays+based+on+IonWorks+Quattro+and+thallium+flux.">Comparison of human Ether-&#225;-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).</li></ol>

Terwijl de membraanpotentiaal-gevoelige fluorescente kleurstoffen zijn gebruikt om medicijnen die ionkanalen moduleren 9,10 te identificeren, dit is het eerste verslag van hun aanvraag voor neuronale GIRK kanaal drug discovery. De GIRK kanaal fluorescentie hier gepresenteerde biedt een snelle, betrouwbare en real-time methode voor de screening van ligand-gated K + kanalen. De test kan worden aangepast voor gebruik met een groot aantal cellen inclusief geïmmortaliseerde cellijnen (HEK293, CHO, enz....

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10-013 </td></tr><tr><td> Paardenserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16050-114 </td></tr><tr><td> 96-wells platen </td><td> Corning </td><td> 3603 </td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4707 </td></tr><tr><td> Somatostatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9129 </td></tr><tr><td> Carbachol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4382 </td></tr><tr><td> HLB 021-152 </td><td> AnaSpec </td><td> 89300 </td></tr><tr><td> Versette geautomatiseerde vloeibare handler </td><td> ThermoFisher </td><td> 650-01 </td></tr><tr><td> Synergy2 fluorescerende plaat reader </td><td> Biotek </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 analyse software </td><td> Biotek </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Tabel specifieke reagentia en materialen.

a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels

G-eiwit-gated naar binnen gelijkrichter K + (GIRK) kanalen functioneren als cellulaire mediatoren van een breed scala van hormonen en neurotransmitters en worden uitgedrukt in de hersenen, het hart, de skeletspieren en endocriene weefsel 1,2. GIRK kanalen worden geactiveerd na de binding van liganden (neurotransmitters, hormonen, drugs, enz.) om hun plasma-membraan-gebonden, G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR&#39;s). Deze binding veroorzaakt de stimulatie van G-eiwitten (G i G en o), dat vervolgens binden en activeren GIRK kanaal. Eenmaal geopend de GIRK kanaal maakt het mogelijk de beweging van K + uit de cel, waardoor de rust membraanpotentiaal om meer negatief. Bijgevolg GIRK kanaal activering in neuronen afneemt spontane vorming van actiepotentiaal en remt de afgifte van neurotransmittoren. In het hart, de activering van de GIRK kanaal remt pacemaker-activiteit waardoor het vertragen van de hartslag. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; GIRK kanalen vormen nieuwe targets voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische middelen voor de behandeling neuropathische pijn, drugsverslaving, hartritmestoornissen en andere aandoeningen 3. Echter, de farmacologie van deze kanalen nog grotendeels onontgonnen. Hoewel een aantal geneesmiddelen, waaronder anti-aritmische middelen, antipsychotica en antidepressiva blokkeren de GIRK kanaal, deze remming is niet selectief en komt voor bij relatief hoge concentraties van de stof 3. We beschrijven hier een real-time screening test voor het identificeren van nieuwe modulatoren van GIRK kanalen. In deze assay worden neuronale AtT20 cellen tot expressie GIRK kanalen geladen membraan potentiaal gevoelige fluorescerende kleurstoffen zoals bis-(1,3-dibutylbarbituric zuur) trimethine-oxonol [DiBAC 4 (3)] of HLB 021-152 (figuur 1 ). De kleurstofmoleculen wordt sterk fluorescerend volgende opname in de cellen (Figuur 1). Behandelingvan de cellen met GPCR liganden stimuleert GIRK kanalen te openen. De resulterende K + efflux de cel veroorzaakt het membraan mogelijk om meer negatieve en het fluorescentiesignaal dalen (figuur 1). Zo kunnen medicijnen die K + efflux moduleren door het GIRK kanaal worden getest met behulp van een fluorescerende plaat lezer. In tegenstelling tot andere ionkanaal screeningstesten, zoals atomaire absorptiespectrometrie 4 of radiotracer analyse 5, de GIRK kanaal fluorescentie biedt een snelle, real-time en goedkope screening procedure.

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels at JoVE.com

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Een real-time screening procedure voor het identificeren van geneesmiddelen die een interactie met G-eiwit-gated naar binnen gelijkrichter K<sup&gt; +</sup&gt; (GIRK) kanalen beschreven. De test maakt gebruik van membraanpotentiaal-gevoelige fluorescente kleurstoffen op GIRK activiteit op het kanaal te meten. Deze techniek is geschikt voor toepassing op een aantal cellijnen.

Een TL-screeningstest voor het vaststellen van Modulators van GIRK kanalen

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening &#39;en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Omzetting van een Capture ELISA aan een Luminex xMAP test met behulp van een Multiplex Antilichaam screeningsmethode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

High-throughput screening voor kleine-molecule Modulators van Actieve Rectifier kaliumkanalen

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Een proteoliposome-Based Efflux Assay om Enkelmolecuul Eigenschappen van Cl Bepaal<sup&gt; -</sup&gt; Kanalen en Transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetische barcodes met fluorescerende eiwitten voor multiplexverzending Toepassingen

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Evaluatie van de zebravis Kidney Functie Met behulp van een TL-Ontruiming Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...