Name: a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels
Uploaded: 2012-04-24T13:00:00
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Diese Arbeit wurde vom US Public Health Service Award NS-071530 gefördert.

1. Herstellung von Zellen <ol><li> Wachsen Hypophyse AtT20-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% Pferdeserum und aufrechtzuerhalten Kulturen bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 ergänzt. </li><li> Pflegen Sie die Kultur durch Subkultivierung der Zellen alle 5 bis 7 Tage mit einem Standard-Verfahren Trypsinierung. </li><li> Die Vertiefungen von schwarzen, klaren unten, 96-well Platten mit 50 ul von Poly-L-Lysin. Die Vertiefungen für 30 Minuten in den Inkubator z...

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	<li>Hibino, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifying+potassium+channels:+their+structure,+function+and+physiological+roles.">Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles.</a> Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).</li><li>Lusscher, C., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+for+G+protein-gated+inwardly+rectifying+potassium+(GIRK)+channels+in+health+and+disease.">Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).</li><li>Kobayashi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-activated+inwardly+rectifying+potassium+channels+as+potential+therapeutic+targets.">G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets.</a> Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).</li><li>Terstappen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+native+and+recombinant+ion+channels+using+a+high-capacity+nonradioactive+rubidium+efflux+assay.">Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay.</a> Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).</li><li>Cheng, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+HERG+potassium+channel+function+assay:+an+old+assay+with+a+new+look.">A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).</li><li>Zhang, J. -. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).</li><li>Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+Ether-&#225;-go-go+related+gene+screening+assays+based+on+IonWorks+Quattro+and+thallium+flux.">Comparison of human Ether-&#225;-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).</li></ol>

Während Membranpotential Fluoreszenzfarbstoffe verwendet wurden, um Medikamente, die Ionenkanäle modulieren 9,10 zu identifizieren, ist dies der erste Bericht über ihre Anwendung für die neuronale GIRK Channel Drug Discovery. Die GIRK Kanal Fluoreszenz-Assay hier vorgestellten bietet eine schnelle, zuverlässige und Echtzeit-Methode für das Screening von Liganden-gesteuerte K +-Kanäle. Der Assay kann zur Verwendung mit einer Vielzahl von Zellen, einschließlich immortalisierten Zelllinien (HE...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10-013 </td></tr><tr><td> Pferdeserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16050-114 </td></tr><tr><td> 96-Well-Platten </td><td> Corning </td><td> 3603 </td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4707 </td></tr><tr><td> Somatostatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9129 </td></tr><tr><td> Carbachol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4382 </td></tr><tr><td> HLB 021-152 </td><td> AnaSpec </td><td> 89300 </td></tr><tr><td> Versette automatisierten Liquid Handler </td><td> ThermoFisher </td><td> 650-01 </td></tr><tr><td> Synergy2 fluoreszierenden Platte Leser </td><td> Biotek </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 Analyse software </td><td> Biotek </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte.

a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels

G-Protein-gesteuerten K + Einwärtsgleichrichter (GIRK) Kanäle fungieren als zelluläre Mediatoren einer Vielzahl von Hormonen und Neurotransmittern und im Gehirn, Herz, Skelettmuskel und endokrines Gewebe 1,2 ausgedrückt. GIRK Kanäle aktiviert werden nach der Bindung von Liganden (Neurotransmitter, Hormone, Arzneimittel, etc.), um die Plasma-Membran-gebundenen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). Diese Bindung bewirkt, dass die Stimulation des G-Proteine ​​(G i und G o), die anschließend zu binden und aktivieren Sie die GIRK Kanal. Nach dem Öffnen der GIRK Kanal erlaubt die Bewegung von K + aus der Zelle verursacht das Ruhemembranpotential zu mehr negativ. Als Folge davon sinkt GIRK Kanal-Aktivierung in Neuronen spontane Aktionspotential Bildung und hemmt die Freisetzung von exzitatorischen Neurotransmittern. Im Herzen, hemmt die Aktivierung des GIRK Kanal Schrittmacher-Aktivität dadurch eine Verlangsamung der Herzfrequenz. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; GIRK Kanäle neuartigen Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Therapeutika für die Behandlung neuropathischer Schmerzen, Drogensucht, Herzrhythmusstörungen und anderen Erkrankungen 3. Allerdings bleibt die Pharmakologie dieser Kanäle weitgehend unerforscht. Obwohl eine Reihe von Medikamenten, einschließlich Antiarrhythmika, Antipsychotika und Antidepressiva die GIRK Kanal blockieren, ist diese Hemmung nicht selektiv und bei relativ hohen Wirkstoffkonzentrationen 3. Hier beschreiben wir eine Echtzeit-Screening-Test zur Identifizierung neuer Modulatoren von GIRK Kanäle. In diesem Assay werden neuronalen AtT20-Zellen, die GIRK Kanäle mit Membranpotential Fluoreszenzfarbstoffe, wie Bis-(1,3-dibutylbarbituric Säure) geladen Trimethin Oxonol [Dibac 4 (3)] oder HLB 021-152 (1 ). Die Farbstoffmoleküle werden stark fluoreszierende folgende Aufnahme in die Zellen (Abbildung 1). Behandlungder Zellen mit GPCR-Liganden stimuliert die GIRK Kanäle zu öffnen. Das resultierende K +-Ausstrom aus der Zelle bewirkt, dass das Membranpotential zu werden negativ und das Fluoreszenzsignal zu verringern (Abbildung 1). So können Medikamente, die K +-Ausstrom modulieren durch den Kanal GIRK untersucht mit Hilfe eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät werden. Im Gegensatz zu anderen Ionenkanal-Screening-Assays, wie Atomabsorptionsspektrometrie 4 oder Radiotracer Analyse 5 stellt die GIRK Kanal Fluoreszenz-Assay einen schnellen, in Echtzeit und kostengünstige Screening-Verfahren.

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A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Ein Echtzeit-Screening-Verfahren zur Identifizierung von Medikamenten, die mit G-Protein-gated Einwärtsgleichrichter K interagieren<sup&gt; +</sup&gt; (GIRK) Kanälen beschrieben. Der Test basiert Membranpotential Fluoreszenzfarbstoffe zu GIRK Kanal-Aktivität zu messen. Diese Technik eignet sich sowohl für den Einsatz auf einer Reihe von Zelllinien.

Ein fluoreszierendes Screening Assay zur Identifizierung von Modulatoren der GIRK Kanäle

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Forschung

Biologie

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

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High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

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Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

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High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

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Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

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Ein Proteoliposom Basierte Efflux-Assay auf Einzelmoleküleigenschaften von Cl Bestimmen<sup&gt; -</sup&gt; Kanäle und Transporter

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Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine ​​für Multiplex-Anwendungen

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

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