Name: a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels
Uploaded: 2012-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי ארצות הברית בפרס אישי שירות הבריאות NS-071530.

1. הכנת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול יותרת המוח AtT20 תאים במדיום שונה Dulbecco של הנשרים (DMEM) השלימו עם סרום סוס 10% ולשמור על תרבויות על 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על התרבות התאים על ידי subculturing כ...

<ol>
	<li>Hibino, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifying+potassium+channels:+their+structure,+function+and+physiological+roles.">Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles.</a> Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).</li><li>Lusscher, C., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+for+G+protein-gated+inwardly+rectifying+potassium+(GIRK)+channels+in+health+and+disease.">Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).</li><li>Kobayashi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-activated+inwardly+rectifying+potassium+channels+as+potential+therapeutic+targets.">G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets.</a> Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).</li><li>Terstappen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+native+and+recombinant+ion+channels+using+a+high-capacity+nonradioactive+rubidium+efflux+assay.">Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay.</a> Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).</li><li>Cheng, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+HERG+potassium+channel+function+assay:+an+old+assay+with+a+new+look.">A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).</li><li>Zhang, J. -. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochem. 37, 13291-13299 (1998).</li><li>Inomata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-arrhythmic+agents+act+differently+on+the+activation+phase+of+the+Ach-response+in+guinea+pig+atrial+myocytes.">Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).</li><li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+high+throughput+functional+assay+methods+for+HERG+potassium+channel.">Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel.</a> J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).</li><li>Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+membrane+potential-sensitive+fluorescent+probes+and+their+use+in+ion+channel+screening+assays.">Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).</li><li>Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).</li><li>Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+Ether-&#225;-go-go+related+gene+screening+assays+based+on+IonWorks+Quattro+and+thallium+flux.">Comparison of human Ether-&#225;-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).</li></ol>

למרות הפוטנציאל רגישים קרום צבעי ניאון נעשה שימוש כדי לזהות תרופות אשר לווסת תעלות יונים 9,10, זהו הדו&quot;ח הראשון של בקשתם העצבית GIRK ערוץ גילוי תרופות. Assay ערוץ GIRK ניאון המובא כאן מספק שיטה מהירה, אמינה בזמן אמת להקרנה של ליגנד, מגודרת K + ערוצים. Assay ניתן לשנו?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10-013 </td></tr><tr><td> סוס סרום </td><td> Invitrogen </td><td> 16050-114 </td></tr><tr><td> 96-גם צלחות </td><td> קורנינג </td><td> 3603 </td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4707 </td></tr><tr><td> Somatostatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9129 </td></tr><tr><td> Carbachol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4382 </td></tr><tr><td> HLB 021-152 </td><td> AnaSpec </td><td> 89300 </td></tr><tr><td> Versette המטפל נוזל אוטומטי </td><td> ThermoFisher </td><td> 650-01 </td></tr><tr><td> Synergy2 צלחת ניאון הקורא </td><td> Biotek </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 ניתוח שלoftware </td><td> Biotek </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1. טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד.

a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels

G-חלבון סגורות פנימה מיישר K + (GIRK) ערוצים לתפקד כמתווכים הסלולר של מגוון רחב של הורמונים נוירוטרנסמיטורים באים לידי ביטוי השרירים, המוח, הלב ורקמות שלד 1,2 האנדוקרינית. ערוצי GIRK להיות מופעל בעקבות עקידת ligands (נוירוטרנסמיטורים, הורמונים, תרופות וכו &#39;) כדי פלזמה שלהם קרום הנכנס, G חלבונים מצמידים קולטנים (GPCRs). מחייב זה גורם לגירוי של חלבונים G (G I ו-G o) אשר לאחר מכן לאגד ולהפעיל את ערוץ GIRK. פעם אחת פתחתי את ערוץ GIRK מאפשר תנועה של K + מחוץ לתא גורמת קרום מנוחה הפוטנציאל להיות שלילי יותר. כתוצאה מכך, הפעלת GIRK ערוץ בנוירונים פוחתת היווצרות ספונטנית פוטנציאל פעולה מעכב שחרור של שליחים עצביים מעוררים. בלב, הפעלת ערוץ GIRK מעכב פעילות הקוצב ובכך להאט את קצב הלב. <p= &quot;jove_content&quot; הכיתה&gt; ערוצי GIRK לייצג מטרות חדשות לפיתוח תרופות טיפוליות חדשות לטיפול בכאב נוירופתי, התמכרות לסמים, הפרעות בקצב הלב והפרעות אחרות 3. עם זאת, פרמקולוגיה של ערוצים אלה עדיין נודעת בעיקר. למרות מספר תרופות כולל נגד סוכני בקצב לא סדיר, תרופות אנטי פסיכוטיות וכן תרופות נוגדות דיכאון לחסום את הערוץ GIRK, עיכוב זה אינו סלקטיבי מתרחש בריכוזים גבוהים יחסית סמים 3. כאן אנו מתארים assay בזמן אמת ההקרנה לזיהוי מאפננים חדשים של ערוצי GIRK. ב assay זה, תאים עצביים AtT20, אשר הביעו את ערוצי GIRK, נטענים עם פוטנציאל רגיש צבעים קרום ניאון כגון bis-(1,3-dibutylbarbituric חומצה) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] או HLB 021-152 (איור 1 ). את מולקולות צבע להיות ספיגת הבאה ניאון חזק אל תוך התאים (איור 1). טיפולשל תאים עם ligands GPCR מגרה ערוצי GIRK לפתוח. כתוצאה K + בזרימת מחוץ לתא גורמת פוטנציאל הממברנה להיות שלילית יותר את האות ניאון כדי להקטין (איור 1). לכן, תרופות לווסת K + בזרימת דרך ערוץ GIRK ניתן ושם ישקלו לו ויעריכו באמצעות הקורא הצלחת ניאון. שלא כמו אחרים ערוץ יון מבחני המיון, כגון ספיגת ספקטרומטריית אטומית 4 או 5 radiotracer ניתוח, assay ערוץ GIRK ניאון מספק בהליך מיון מהיר, בזמן אמת ולא יקר.

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels at JoVE.com

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

בזמן אמת ההקרנה הליך לזיהוי סמים כי אינטראקציה עם חלבון G-מגודרת פנימה מיישר K<sup&gt; +</sup&gt; (GIRK) ערוצים מתואר. Assay מנצל פוטנציאל רגישות קרום צבעי ניאון כדי למדוד פעילות GIRK הערוץ. טכניקה זו ניתנת להתאמה לשימוש על מספר שורות תאים.

Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposome מבוסס הזרימה Assay כדי לקבוע מאפייני מולקולה בודדת של Cl<sup-&gt;</sup&gt; ערוצים ומסועים

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Barcoding הגנטי עם חלבונים ניאון עבור יישומי Multiplexed

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...