Name: a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels
Uploaded: 2012-04-24T13:00:00
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1。細胞の調製<ol><li> 5％CO 2の加湿雰囲気で10％ウマ血清、37℃で培養を維持すると補足したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で下垂体AtT20細胞を成長させる。 </li><li>標準的なトリプシン処理プロシージャを使用してすべての5〜7日の細胞を継代培養により培養を維持しています。 </li><li>コー​​ト、黒、透明底のウェル、ポリ-L-リジンの50μL、96ウェルプレート。井戸はインキュ?...

<ol>
	<li>Hibino, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifying+potassium+channels:+their+structure,+function+and+physiological+roles.">Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles.</a> Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).</li><li>Lusscher, C., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+for+G+protein-gated+inwardly+rectifying+potassium+(GIRK)+channels+in+health+and+disease.">Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).</li><li>Kobayashi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-activated+inwardly+rectifying+potassium+channels+as+potential+therapeutic+targets.">G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets.</a> Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).</li><li>Terstappen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+native+and+recombinant+ion+channels+using+a+high-capacity+nonradioactive+rubidium+efflux+assay.">Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay.</a> Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).</li><li>Cheng, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+HERG+potassium+channel+function+assay:+an+old+assay+with+a+new+look.">A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).</li><li>Zhang, J. -. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochem. 37, 13291-13299 (1998).</li><li>Inomata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-arrhythmic+agents+act+differently+on+the+activation+phase+of+the+Ach-response+in+guinea+pig+atrial+myocytes.">Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).</li><li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+high+throughput+functional+assay+methods+for+HERG+potassium+channel.">Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel.</a> J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).</li><li>Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+membrane+potential-sensitive+fluorescent+probes+and+their+use+in+ion+channel+screening+assays.">Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).</li><li>Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).</li><li>Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+Ether-&#225;-go-go+related+gene+screening+assays+based+on+IonWorks+Quattro+and+thallium+flux.">Comparison of human Ether-&#225;-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).</li></ol>

膜電位感受性蛍光色素がイオンチャネルを調節する薬物9,10を識別するために使用されているが、これはニューロンのGIRKチャネル創薬への応用の最初の報告である。ここに提示GIRKチャネルの蛍光アッセイは、リガンド依存性K +チャネルのスクリーニングのための、高速で信頼性の高いリアルタイムメソッドを提供します。アッセイは、内因性のチャネルを発現している外因性...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10から013 </td></tr><tr><td>ウマ血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 16050-114 </td></tr><tr><td> 96ウェルプレート</td><td>コー​​ニング</td><td> 3603 </td></tr><tr><td>ポリエルリジン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P4707 </td></tr><tr><td>ソマトスタチン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> S9129 </td></tr><tr><td>カルバコール</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> C4382 </td></tr><tr><td> HLB 021から152 </td><td> AnaSpec </td><td> 89300 </td></tr><tr><td> Versette自動化された液体ハンドラ</td><td>サーモフィッシャー</td><td> 650から01 </td></tr><tr><td> Synergy2蛍光プレートリーダー</td><td>バイオテック</td><td></td></tr><tr><td> GEN5分析のoftware </td><td>バイオテック</td><td></td></tr></tbody></table> 表1特定の試薬 ​​や機器の表。

a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels

Gタンパク質依存性内向き整流K +（GIRK）チャンネルはホルモンや神経伝達物質の広い範囲の細胞のメディエーターとして機能し、脳、心臓、骨格筋、内分泌組織の1,2で表されます。 GIRKチャネルは、それらの細胞膜結合型のリガンド（神経伝達物質、ホルモン、薬物など）、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）の結合後に有効になります。この結合は、その後に結合し、GIRKチャネルを活性化するGタンパク質（G iとG o）の刺激を引き起こす。一度GIRKチャネルは、Kの動きを可能にする+外より負になるための静止膜電位を引き起こす細胞からオープンしました。その結果、ニューロンのGIRKチャネルの活性化は、自発的活動電位の形成を減少させ、興奮性神経伝達物質の放出を阻害する。心の中で、GIRKチャネルの活性化は、それによって心拍数を遅くするペースメーカー活性を阻害する。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt; GIRKチャネルは、神経因性疼痛治療、薬物中毒、不整脈や他の疾患3の新しい治療薬の開発のための新たな目標を表すものです。しかし、これらのチャネルの薬理学は、主に未踏のままです。抗不整脈薬、抗精神病薬や抗うつ薬を含む薬物の数は、GIRKチャネルをブロックするが、この阻害は選択ではなく、相対的に高い薬物濃度を3で発生します。 ここでは、GIRKチャネルの新たなモジュレーターを同定するためのリアルタイムスクリーニングアッセイを説明します。このアッセイでは、GIRKチャネルを発現神経AtT20細胞は、例えば、ビス- （1,3 - dibutylbarbituric酸）トリメチンオキソノール[DiBAC 4（3）]またはHLB 021から152（ 図1のような膜電位感受性蛍光色素を使用してロードされ。）色素分子は、細胞（ 図1）に強い蛍光を、次の取り込みになります。治療GPCRリガンドと細胞のGIRKチャネルを開くために刺激する。細胞外の結果K +流出は、膜電位がより負と減少する蛍光シグナル（ 図1）になるようになります。したがって、GIRKチャネルを介してK +流出を調節する薬剤は蛍光プレートリーダーを用いてアッセイすることができます。他のイオンチャネルスクリーニングアッセイなど、原子吸光分析法4または放射性トレーサー解析5と異なり、GIRKチャネル蛍光アッセイは、高速リアルタイムかつ安価なスクリーニング法を提供します。

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A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Gタンパク質依存性内向き整流Kと相互作用する薬剤を同定するためのリアルタイムスクリーニングの手順<sup&gt; +</sup&gt;（GIRK）チャンネルが記載されています。アッセイは、GIRKチャネル活性を測定する膜電位感受性蛍光色素を利用しています。この手法は、セルの行数での使用に適応可能である。

GIRKチャネルのモジュレーターを同定するための蛍光スクリーニングアッセイ

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

多重抗体スクリーニング法を用いたLuminex XMAPアッセイへの捕捉ELISAの変換

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

内向き整流カリウムチャネルの小分子モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

プロテオリポソー​​ムベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する<sup&gt; -</sup&gt;チャネルとトランスポーター

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

多重化アプリケーションのための蛍光タンパク質との遺伝バーコーディング

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...