Name: a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels
Uploaded: 2012-04-24T13:00:00
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1. 세포의 준비 <ol><li> 5% CO 2의 humidified 분위기에서 10 %의 목마 혈청 및 37 ° C에서 문화를 유지와 보완 Dulbecco의 수정된 이글 배지 (DMEM)에서 뇌하수체 AtT20 세포를 성장. </li><li> 표준 trypsinization 절차를 사용하여 세포에게 5-7일마다 subculturing하여 문화를 유지합니다. </li><li> 검정, 투명 하단의 문장은 우물, 폴리-L-라이신의 50 μL와 96 - 웰 플레이트. 우물은 인큐베이터에서 30 분 동안 건조하?...

<ol>
	<li>Hibino, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifying+potassium+channels:+their+structure,+function+and+physiological+roles.">Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles.</a> Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).</li><li>Lusscher, C., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+for+G+protein-gated+inwardly+rectifying+potassium+(GIRK)+channels+in+health+and+disease.">Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).</li><li>Kobayashi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-activated+inwardly+rectifying+potassium+channels+as+potential+therapeutic+targets.">G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets.</a> Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).</li><li>Terstappen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+native+and+recombinant+ion+channels+using+a+high-capacity+nonradioactive+rubidium+efflux+assay.">Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay.</a> Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).</li><li>Cheng, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+HERG+potassium+channel+function+assay:+an+old+assay+with+a+new+look.">A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).</li><li>Zhang, J. -. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochem. 37, 13291-13299 (1998).</li><li>Inomata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-arrhythmic+agents+act+differently+on+the+activation+phase+of+the+Ach-response+in+guinea+pig+atrial+myocytes.">Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).</li><li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+high+throughput+functional+assay+methods+for+HERG+potassium+channel.">Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel.</a> J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).</li><li>Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+membrane+potential-sensitive+fluorescent+probes+and+their+use+in+ion+channel+screening+assays.">Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).</li><li>Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).</li><li>Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+Ether-&#225;-go-go+related+gene+screening+assays+based+on+IonWorks+Quattro+and+thallium+flux.">Comparison of human Ether-&#225;-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).</li></ol>

막 잠재력에 민감한 형광 염료가 이온 채널 조절 약물 9,10을 식별하는 데 사용되었습니다 있지만, 이것의 연결을 GIRK 채널 약물 발견에 대한 자신의 응용 프로그램의 첫 번째 보고서이다. 여기서 제시 GIRK 채널 형광 분석은 리간드 게이트 K + 채널의 심사를위한 빠르고, 신뢰할 수있는 실시간 방식을 제공합니다. 검정은 외인성 재조합 GIRK 채널 11 clonal 셀 라인 (AtT20, PC-12) 내...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10-013 </td></tr><tr><td> 말 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 16050-114 </td></tr><tr><td> 96 - 웰 플레이트 </td><td> 코닝 </td><td> 3603 </td></tr><tr><td> 폴리-L-라이신 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P4707 </td></tr><tr><td> Somatostatin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S9129 </td></tr><tr><td> Carbachol </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C4382 </td></tr><tr><td> HLB 021-152 </td><td> AnaSpec </td><td> 89,300 </td></tr><tr><td> Versette 자동 액체 처리기 </td><td> ThermoFisher </td><td> 650-01 </td></tr><tr><td> Synergy2 형광 플레이트 리더 </td><td> Biotek </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 분석의oftware </td><td> Biotek </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 특정 시약 및 장비의 표.

a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels

G 단백질 문이 안쪽 정류기 K + (GIRK) 채널은 호르몬과 신경 전달 물질의 광범위한 셀룰러 중재자 역할과 뇌, 심장, 골격근 및 내분비 조직 1,2로 표현됩니다. GIRK 채널들은 플라즈마 멤브레인 바인딩된, G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)에 (신경 전달 물질, 호르몬, 약물 등) 리간드의 바인딩에 따라 활성화된다. 이 바인딩은 이후에 바인딩하고 GIRK 채널을 활성화 G 단백질 (G i와 G O)의 자극을 초래합니다. 일단 GIRK 채널은 K의 움직임 +에서 더 많은 부정이 될 가능성이 휴식 멤브레인를 일으키는 세포의 수 있습니다 열었습니다. 결과적으로 뉴런에 GIRK 채널 인증은 자발적인 행동 잠재력의 형성을 감소하고 흥분성의 신경 전달 물질의 석방을 억제. 마음에 GIRK 채널의 활성화함으로써 심장 박동을 둔화 맥박 조정기의 활동을 억제. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; GIRK 채널은 치료 neuropathic 고통, 마약 중독, 심장 arrhythmias 및 기타 장애 3에 대한 새로운 치료 대리인의 개발을위한 소설 대상을 나타냅니다. 그러나 이러한 채널 약리학이 크게 미개척 남아 있습니다. 안티 arrhythmic 대리인, 치료약의 약물과 항우울제를 포함한 약물의 숫자 GIRK 채널을 차단 있지만, 이러한 억제는 선택 아니므로 상대적으로 높은 약물 농도 3 시에 발생합니다. 여기서는 GIRK 채널의 새로운 변조기를 식별을위한 실시간 검사 분석을 설명합니다. 본 분석에서는 GIRK 채널을 표현의 연결을 AtT20 세포는 같은 비스 - (1,3-dibutylbarbituric 산)와 같은 멤브레인 가능성에 민감한 형광 염료와 함께로드됩니다 trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] 또는 HLB 021-152 (그림 1 ). 염료 분자 세포 (그림 1)에 강력하게 형광등 아래의 이해가된다. 치료GPCR의 리간드와 세포 열 GIRK 채널 자극. 세포의 결과 K + 유출 아웃 더 음수가 될 수있는 멤브레인 잠재력과 감소하는 형광 신호 (그림 1)을 일으 킵니다. 따라서 GIRK 채널을 통해 K + 유출을 조절 약물은 형광 플레이트 리더를 사용 assayed 수 있습니다. 다른 이온 채널 심사 assays 같은 원자 흡수 분광법 4 radiotracer 분석 5와는 달리, GIRK 채널 형광 분석은 빠른 실시간 저렴 심사 절차를 제공합니다.

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A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G 단백질 문이 안쪽 정류기 K와 상호 작용하는 약물을 식별을위한 실시간 검사 절차<sup&gt; +</sup&gt; (GIRK) 채널이 설명되어 있습니다. 검정은 GIRK 채널 활동을 측정하는 막 잠재력에 민감한 형광 염료를 활용합니다. 이 기술은 세포 라인의 숫자에 사용하기위한 적응이다.

GIRK 채널의 변조기를 식별을위한 형광 검사 분석

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

연구

생물학

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

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형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

멀티 플렉스 항체 검사 방법을 사용하여 Luminex xMAP 분석에 캡처 엘리사의 전환

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

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막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

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Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는<sup&gt; -</sup&gt; 채널 및 전송기

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

멀티 플렉스 애플리케이션을위한 형광 단백질 유전자 바코드

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

형광 정리 분석을 사용하여 Zebrafish의 신장 기능의 평가

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High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...