Name: a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels
Uploaded: 2012-04-24T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelos EUA prémio Serviço Público de Saúde NS-071530.

1. Preparação de Células <ol><li> Crescer pituitárias AtT20 células em meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) suplementado com soro de cavalo a 10% e manter as culturas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2. </li><li> Manter a cultura por repicagem as células a cada 5 a 7 dias utilizando um procedimento de tripsinização padrão. </li><li> Revestimento dos poços de fundo, preto claro, placas de 96 poços com 50 ul de poli-L-lisina. Permitir que os poços para secar durante 30 min na...

<ol>
	<li>Hibino, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifying+potassium+channels:+their+structure,+function+and+physiological+roles.">Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles.</a> Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).</li><li>Lusscher, C., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+for+G+protein-gated+inwardly+rectifying+potassium+(GIRK)+channels+in+health+and+disease.">Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease.</a> Nat. Rev. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).</li><li>Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+Ether-&#225;-go-go+related+gene+screening+assays+based+on+IonWorks+Quattro+and+thallium+flux.">Comparison of human Ether-&#225;-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).</li></ol>

Enquanto potencial de membrana sensíveis corantes fluorescentes foram usados ​​para identificar drogas que modulam canais iônicos 9,10, este é o primeiro relato de sua aplicação para neuronal GIRK droga Discovery Channel. O ensaio GIRK canal fluorescente apresentado aqui fornece um método rápido, confiável e em tempo real para o rastreamento de ligante fechadas canais de K +. O ensaio pode ser modificadas para utilização com uma vasta gama de células incluindo linhas de células imor...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10-013 </td></tr><tr><td> De soro de cavalo </td><td> Invitrogen </td><td> 16050-114 </td></tr><tr><td> Placas de 96 poços </td><td> Corning </td><td> 3603 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4707 </td></tr><tr><td> Somatostatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9129 </td></tr><tr><td> Carbacol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4382 </td></tr><tr><td> HLB 021-152 </td><td> AnaSpec </td><td> 89300 </td></tr><tr><td> Versette manipulador de líquidos automatizado </td><td> ThermoFisher </td><td> 650-01 </td></tr><tr><td> Synergy2 leitor de placas fluorescentes </td><td> Biotek </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 análise software </td><td> Biotek </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Tabela de reagentes específicos e equipamentos.

a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels

Proteína G-gated para dentro do rectificador K + (GIRK) canais de funcionar como mediadores celulares de uma vasta gama de hormonas e neurotransmissores e são expressos no cérebro, coração, músculo esquelético e 1,2 tecido endócrino. Canais GIRK tornar-se activado após a ligação de ligandos (neurotransmissores, hormonas, fármacos, etc) para a sua plasma ligada à membrana, acoplados à proteína G (GPCRs receptores). Esta ligação faz com que a estimulação de proteínas G (G i e G o) que, subsequentemente, se ligar e activar o canal GIRK. Uma vez aberto o canal GIRK permite a circulação de K + para fora da célula fazendo com que a membrana em repouso potencial para se tornar mais negativo. Como conseqüência, GIRK ativação de canais em neurônios diminui a formação de potencial espontâneo de ação e inibe a liberação de neurotransmissores excitatórios. No coração, a activação do canal de GIRK inibe a actividade pacemaker assim abrandar o ritmo cardíaco. <pclass = &quot;&quot; jove_content canais&gt; GIRK representar novos alvos para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para tratamento da dor neuropática, a toxicodependência, arritmias cardíacas e outros distúrbios 3. No entanto, a farmacologia destes canais permanece largamente inexplorado. Embora um número de drogas, incluindo agentes anti-arrítmicos, fármacos antipsicóticos e antidepressivos bloquear o canal GIRK, esta inibição não é seletivo e ocorre em concentrações relativamente elevadas de drogas 3. Aqui, descrevemos um teste de triagem em tempo real para identificar novos moduladores de canais GIRK. Neste ensaio, as células neuronais AtT20, expressando canais GIRK, são carregados com potencial de membrana sensíveis corantes fluorescentes, tais como bis-(1,3-dibutylbarbituric ácido) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] ou HLB 021-152 (Figura 1 ). As moléculas de corante se fortemente fluorescente absorção seguinte para dentro das células (Figura 1). Tratamentodas células com ligandos GPCR estimula os canais GIRK para abrir. A resultante de K + de efluxo para fora da célula faz com que o potencial de membrana a tornar-se mais negativa e do sinal fluorescente para diminuir (Figura 1). Assim, as drogas que modulam a K + efluxo através do canal GIRK pode ser ensaiada utilizando um leitor de placa fluorescente. Ao contrário de outros íons ensaios canal de rastreio, espectrometria de absorção atômica, tais 4 ou análise radiotraçador 5, o canal fluorescente GIRK ensaio fornece um procedimento de triagem rápida, em tempo real e barato.

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A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Um procedimento de triagem em tempo real para identificação de drogas que interagem com a proteína G-gate dentro retificador K<sup&gt; +</sup&gt; (GIRK) canais é descrito. O ensaio utiliza potencial de membrana sensíveis corantes fluorescentes para medir GIRK actividade do canal. Esta técnica é adaptável para utilização num certo número de linhas celulares.

Um ensaio de rastreio fluorescente para identificação Moduladores de Canais GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Biologia

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

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Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

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High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase

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Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

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Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

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A proteolipossoma-Based Efluxo Ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canais e Transportadores

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

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Barcoding Genetic com proteínas fluorescentes para Aplicações Multiplexados

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