Name: a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels
Uploaded: 2012-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels at JoVE.com

Эта работа была поддержана США Public Health Service награды NS-071 530.

1. Подготовка клетки <ol><li> Рост клеток гипофиза AtT20 в среде Дульбекко изменения Орла (DMEM) с добавлением 10% лошадиной сыворотки и поддерживать культуру при температуре 37 ° C во влажной атмосфере 5% CO 2. </li><li> Поддерживать культуру пересева клеток каждые 5 до 7 дней, используя стандартну?...

<ol>
	<li>Hibino, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifying+potassium+channels:+their+structure,+function+and+physiological+roles.">Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles.</a> Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).</li><li>Lusscher, C., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+for+G+protein-gated+inwardly+rectifying+potassium+(GIRK)+channels+in+health+and+disease.">Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).</li><li>Kobayashi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-activated+inwardly+rectifying+potassium+channels+as+potential+therapeutic+targets.">G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets.</a> Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).</li><li>Terstappen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+native+and+recombinant+ion+channels+using+a+high-capacity+nonradioactive+rubidium+efflux+assay.">Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay.</a> Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).</li><li>Cheng, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+HERG+potassium+channel+function+assay:+an+old+assay+with+a+new+look.">A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).</li><li>Zhang, J. -. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochem. 37, 13291-13299 (1998).</li><li>Inomata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-arrhythmic+agents+act+differently+on+the+activation+phase+of+the+Ach-response+in+guinea+pig+atrial+myocytes.">Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).</li><li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+high+throughput+functional+assay+methods+for+HERG+potassium+channel.">Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel.</a> J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).</li><li>Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+membrane+potential-sensitive+fluorescent+probes+and+their+use+in+ion+channel+screening+assays.">Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).</li><li>Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).</li><li>Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+Ether-&#225;-go-go+related+gene+screening+assays+based+on+IonWorks+Quattro+and+thallium+flux.">Comparison of human Ether-&#225;-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).</li></ol>

В то время как мембранный потенциал-чувствительные флуоресцентные красители были использованы для идентификации препаратов, которые модулируют ионных каналов 9,10, это первый доклад их применения для нейронов GIRK канал лекарственных препаратов. GIRK канала флуоресцентного анализа...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10-013 </td></tr><tr><td> Лошадиная сыворотка </td><td> Invitrogen </td><td> 16050-114 </td></tr><tr><td> 96-луночных </td><td> Гранулирование </td><td> 3603 </td></tr><tr><td> Поли-L-лизин </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4707 </td></tr><tr><td> Соматостатин </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9129 </td></tr><tr><td> Карбахолина </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4382 </td></tr><tr><td> HLB 021-152 </td><td> AnaSpec </td><td> 89300 </td></tr><tr><td> Versette автоматизированные обработчик жидкости </td><td> ThermoFisher </td><td> 650-01 </td></tr><tr><td> Synergy2 люминесцентные планшетов </td><td> Биотек </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 анализ сoftware </td><td> Биотек </td><td></td></tr></tbody></table> Таблица 1. Таблица специфических реагентов и оборудования.

a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels

G белка закрытого внутреннего выпрямителя K + (GIRK) каналы работают, как сотовые посредников широкий спектр гормонов и нейромедиаторов и выражаются в головной мозг, сердце, скелетные мышцы и 1,2 эндокринной ткани. GIRK каналы активируются после связывания лигандов (нейромедиаторов, гормонов, лекарств и т.д.), их плазма мембраной, G-белком рецепторы (GPCR). Это связывание приводит к стимуляции G белка (G я и G о), которая впоследствии связывать и активировать канал GIRK. После открытия канала GIRK позволяет движение К + из клетки вызывает покоя мембранный потенциал, чтобы стать более отрицательным. Как следствие, GIRK канала активации нейронов уменьшается спонтанное формирование потенциала действия и ингибирует высвобождение возбуждающих нейротрансмиттеров. В сердце активации канала GIRK ингибирует активность водителя ритма, замедляя тем самым частоту сердечных сокращений. <pкласс = &quot;jove_content&quot;&gt; GIRK каналы представляют собой новых целей для разработки новых терапевтических агентов для лечения нейропатической боли, наркомания, нарушения ритма сердца и других заболеваний 3. Тем не менее, фармакологии этих каналов остается мало изученной. Несмотря на ряд лекарственных средств, включая антиаритмические препараты, антипсихотические средства и антидепрессанты блокируют канал GIRK, это торможение не является избирательным и происходит при относительно высокой концентрации препарата 3. Здесь мы описываем в режиме реального времени скрининге для выявления новых модуляторов каналов GIRK. В данном анализе нейронов AtT20 клетки, выражая GIRK каналы, которые загружаются с мембранный потенциал-чувствительные флуоресцентные красители, такие как бис-(1,3-dibutylbarbituric кислота) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] или HLB 021-152 (рис. 1 ). Молекул красителя стало сильно люминесцентные следующие поступления в клетки (рис. 1). Лечениеклеток с лигандами GPCR стимулирует GIRK каналы, чтобы открыть. В результате отток K + из клетки приводит к тому, мембранный потенциал, чтобы стать более отрицательным и флуоресцентного сигнала уменьшается (рис. 1). Таким образом, препараты, которые модулируют K + истечение через канал GIRK могут быть проанализированы помощью флуоресцентных планшетов. В отличие от других ионных каналов скрининга, например атомно-абсорбционной спектрометрии 4 или радиоактивный анализ 5 канал GIRK флуоресцентного анализа позволяет быстро, в режиме реального времени и недорогая процедура отбора.

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels at JoVE.com

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

В режиме реального времени процедура скрининга для выявления наркотиков, которые взаимодействуют с G белком закрытый внутренний выпрямитель K<sup&gt; +</sup&gt; (GIRK) каналов описана. Анализ использует мембранный потенциал-чувствительные флуоресцентные красители для измерения GIRK канал деятельности. Этот метод можно адаптировать для использования на нескольких клеточных линий.

Флуоресцентные Анализ Скрининг на выявление каналов модуляторы GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Мутагенеза и функционального анализа ионных каналов Heterologously Выраженный в клетках млекопитающих

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Высокопроизводительный скрининг и биодатчиков с люминесцентными С. Элеганс Штаммы

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Преобразование Capture ИФА в Пробирной Luminex Xmap помощью скрининга Мультиплекс антител методом

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Высокопроизводительного скрининга для малых молекул модуляторы калиевых каналов входящего Rectifier

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Высокая пропускная Функциональная Скрининг с использованием Домашнее двойного свечения люциферазы

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposome-Based Efflux Анализ для определения одиночных молекул Свойства Cl<sup&gt; -</sup&gt; Каналы и перевозчиков

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Генетический штрих кода с флуоресцентных белков для мультиплексированных приложений

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Оценка данио рерио функции почек с помощью флуоресцентного Зазор Пробирной

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...