Name: a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels
Uploaded: 2012-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels at JoVE.com

Detta arbete stöddes av US Public Health Service Award NS-071.530.

1. Beredning av celler <ol><li> Växa hypofysen AtT20 celler i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% hästserum och bibehålla kulturer vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2. </li><li> Bibehåll kulturen genom subkultur cellerna var 5 till 7 dagar med en vanlig trypsinisering förfarande. </li><li> Belägga brunnarna i svart och klar botten och 96-brunnsplattor med 50 ^ il av poly-L-lysin. Tillåta brunnarna torka under 30 min i inkubatorn. </li><li> Plattan cellerna i 96-bru...

<ol>
	<li>Hibino, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifying+potassium+channels:+their+structure,+function+and+physiological+roles.">Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles.</a> Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).</li><li>Lusscher, C., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+for+G+protein-gated+inwardly+rectifying+potassium+(GIRK)+channels+in+health+and+disease.">Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).</li><li>Kobayashi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-activated+inwardly+rectifying+potassium+channels+as+potential+therapeutic+targets.">G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets.</a> Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).</li><li>Terstappen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+native+and+recombinant+ion+channels+using+a+high-capacity+nonradioactive+rubidium+efflux+assay.">Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay.</a> Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).</li><li>Cheng, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+HERG+potassium+channel+function+assay:+an+old+assay+with+a+new+look.">A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).</li><li>Zhang, J. -. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochem. 37, 13291-13299 (1998).</li><li>Inomata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-arrhythmic+agents+act+differently+on+the+activation+phase+of+the+Ach-response+in+guinea+pig+atrial+myocytes.">Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).</li><li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+high+throughput+functional+assay+methods+for+HERG+potassium+channel.">Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel.</a> J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).</li><li>Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+membrane+potential-sensitive+fluorescent+probes+and+their+use+in+ion+channel+screening+assays.">Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).</li><li>Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).</li><li>Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+Ether-&#225;-go-go+related+gene+screening+assays+based+on+IonWorks+Quattro+and+thallium+flux.">Comparison of human Ether-&#225;-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).</li></ol>

Medan membranpotential-känsliga fluorescerande färgämnen har använts för att identifiera läkemedel som modulerar jonkanaler 9,10, detta är den första rapporten av deras ansökan om neuronal GIRK kanalen läkemedelsutveckling. Den GIRK kanalen fluorescerande analys som presenteras här ger en snabb, pålitlig och i realtid metod för screening av ligand-gated K +-kanaler. Analysen kan modifieras för användning med en mängd olika celler innefattande immortaliserade cellinjer (HEK293, CHO, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013 </td></tr><tr><td> Hästserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16050-114 </td></tr><tr><td> 96-brunnsplattor </td><td> Corning </td><td> 3603 </td></tr><tr><td> Poly-L-lysin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4707 </td></tr><tr><td> Somatostatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9129 </td></tr><tr><td> Karbakol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4382 </td></tr><tr><td> HLB 021-152 </td><td> Anaspec </td><td> 89.300 </td></tr><tr><td> Versette automatiserad vätskehanterare </td><td> ThermoFisher </td><td> 650-01 </td></tr><tr><td> Synergy2 fluorescerande plattläsare </td><td> Biotek </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 analys sROGRAMVARA </td><td> Biotek </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 1. Tabell över specifika reagens och utrustning.

a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels

G-protein-gated inåt likriktartransistorerna K + (GIRK) kanaler fungerar som cellulära mediatorer av en mängd olika hormoner och neurotransmittorer och uttrycks i hjärna, hjärta, skelettmuskel och endokrin vävnad 1,2. GIRK kanaler aktiveras till följd av bindning av ligander (neurotransmittorer, hormoner, läkemedel, etc) till sin plasma membranbunden, G-proteinkopplade receptorer (GPCR). Denna bindning orsakar stimulering av G-proteiner (G ^ och G ^) som därefter binder till och aktiverar GIRK kanalen. När öppnade GIRK kanalen tillåter förflyttning av K + ut ur cellen som orsakar vilande membranpotentialen blir mer negativ. Som en följd minskar GIRK kanalaktivering i neuroner spontan bildning aktionspotential och inhiberar frisättning av excitatoriska neurotransmittorer. I hjärtat hämmar aktivering av GIRK kanalen pacemakern verksamheten och därigenom bromsa hjärtfrekvensen. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; GIRK kanalerna utgör nya mål för utvecklingen av nya läkemedel för behandling neuropatisk smärta, drogberoende, hjärtarytmier och andra störningar 3. Dock fortfarande farmakologi av dessa kanaler i stort sett outforskade. Även om ett antal läkemedel inklusive antiarytmiska medel, läkemedel antipsykotiska och antidepressiva medel blockerar GIRK kanal, är denna inhibering inte selektiv och inträffar vid relativt höga läkemedelskoncentrationer 3. Här beskriver vi ett realtid screeningsanalys för att identifiera nya modulatorer av GIRK kanaler. I denna analys är neuronala AtT20 celler, som uttrycker GIRK kanaler, laddad med membranpotential-känsliga fluorescerande färgämnen, såsom bis-(1,3-dibutylbarbituric syra) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] eller HLB 021-152 (figur 1 ). De färgmolekyler bli starkt fluorescerande efter upptag in i cellerna (Figur 1). Behandlingav cellerna med GPCR-ligander stimulerar GIRK kanaler för att öppna. Den resulterande K + utflöde ur cellen orsakar membranet kan bli mer negativ och den fluorescerande signalen för att minska (figur 1). Således kan läkemedel som modulerar K ^-utflöde genom GIRK kanalen skall analyseras med användning av en fluorescerande plattläsare. Till skillnad från andra screening-jonkanal-analyser, som atomabsorptionsspektrometri 4 eller radiotracer analys 5 ger GIRK kanalen fluorescerande analys en snabb, realtid och billigt urvalsförfarande.

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels at JoVE.com

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

En i realtid screening för identifiering läkemedel som interagerar med G-protein-gated inåt likriktare K<sup&gt; ^</sup&gt; (GIRK) kanaler beskrivs. Analysen utnyttjar membranpotentialen-känsliga fluorescerande färgämnen för att mäta GIRK kanalaktivitet. Denna teknik är anpassningsbar för användning på ett antal cellinjer.

En fluorescerande screeningsanalys för att identifiera modulatorer av GIRK kanaler

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenes och funktionsanalys av jonkanaler Uttryckt Heterologously i däggdjursceller

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Konvertering av en ELISA för att en Luminex xMAP analys med hjälp av en Multiplex metod Antibody Screening

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

High-throughput screening för små molekyler Modulatorer för aktiv kanaler Likriktare Kalium

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Hög kapacitet Funktionell Screening med hjälp av en hemmagjord Dual-glöd luciferas analys

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

En Proteoliposome-Based Efflux analys för att bestämma enda molekyl egenskaper Cl<sup&gt; -</sup&gt; Kanaler och Transportörer

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetisk Barcoding med fluorescerande proteiner för Multiplexade Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Utvärdering av Zebrafish njurfunktion med hjälp av en fluorescerande Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...