Name: a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels
Uploaded: 2012-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels at JoVE.com

Bu çalışma, Amerikan Halk Sağlığı Servisi ödül NS-071.530 tarafından desteklenmiştir.

1. Hücreler hazırlanması <ol><li> % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferinde% 10 at serumu ve 37 ° C&#39;de kültür muhafaza ile desteklenmiş Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde hipofiz hücreleri AtT20 büyür. </li><li> Standart bir tripsinizasyon prosedürü kullanılarak hücrelerin 5-7 günde bir alt kültüre tarafından kültürü muhafaza. </li><li> Siyah, açık bir alt katın kuyuları, poli-L-Lizin 50 uL 96-kuyucuklu plaklar. Kuyular inkübatörde 30 dakika kurumasını...

<ol>
	<li>Hibino, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifying+potassium+channels:+their+structure,+function+and+physiological+roles.">Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles.</a> Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).</li><li>Lusscher, C., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+for+G+protein-gated+inwardly+rectifying+potassium+(GIRK)+channels+in+health+and+disease.">Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).</li><li>Kobayashi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-activated+inwardly+rectifying+potassium+channels+as+potential+therapeutic+targets.">G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets.</a> Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).</li><li>Terstappen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+native+and+recombinant+ion+channels+using+a+high-capacity+nonradioactive+rubidium+efflux+assay.">Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay.</a> Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).</li><li>Cheng, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+HERG+potassium+channel+function+assay:+an+old+assay+with+a+new+look.">A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).</li><li>Zhang, J. -. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochem. 37, 13291-13299 (1998).</li><li>Inomata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-arrhythmic+agents+act+differently+on+the+activation+phase+of+the+Ach-response+in+guinea+pig+atrial+myocytes.">Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).</li><li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+high+throughput+functional+assay+methods+for+HERG+potassium+channel.">Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel.</a> J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).</li><li>Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+membrane+potential-sensitive+fluorescent+probes+and+their+use+in+ion+channel+screening+assays.">Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).</li><li>Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).</li><li>Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+Ether-&#225;-go-go+related+gene+screening+assays+based+on+IonWorks+Quattro+and+thallium+flux.">Comparison of human Ether-&#225;-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).</li></ol>

Membran potansiyeli duyarlı floresan boyalar iyon kanallarını modüle uyuşturucu 9,10 tanımlamak için kullanılmış iken, bu nöronal GIRK kanal ilaç keşfi için uygulama ilk rapordur. Burada sunulan GIRK kanal fluoresan antikor testi ligand kapılı K + kanalları tarama için hızlı, güvenilir ve gerçek zamanlı bir yöntem sağlar. Tahlil, bir eksojen rekombinant GIRK kanalı 11 veya klonal hücre çizgileri (AtT20, PC-12), bir endojen kanalı ifade ifade ölümsüzleştir...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10-013 </td></tr><tr><td> At serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 16050-114 </td></tr><tr><td> 96-kuyucuklu plaklar </td><td> Corning </td><td> 3603 </td></tr><tr><td> Poli-L-Lizin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4707 </td></tr><tr><td> Somatostatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9129 </td></tr><tr><td> Karbakol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4382 </td></tr><tr><td> HLB 021-152 </td><td> AnaSpec </td><td> 89300 </td></tr><tr><td> Versette otomatik sıvı işleyici </td><td> ThermoFisher </td><td> 650-01 </td></tr><tr><td> Synergy2 floresan plaka okuyucu </td><td> BIOTEK </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 analizi software </td><td> BIOTEK </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Özel reaktifler ve ekipman Tablo.

a fluorescent screening assay for identifying modulators of girk channels

G-protein bağımlı içeri düzeltici K + (GIRK) kanalları hormonlar ve nörotransmitterler geniş bir yelpazede hücresel mediatörler olarak işlev ve beyin, kalp, iskelet kas ve endokrin doku 1,2 olarak ifade edilir. GIRK kanallar ve plazma zar bağlı, G proteinine kenetlenmiş reseptörlerin (GPCRs) ila (nörotransmiterler, hormonlar, ilaç vs) ligand bağlama sonra aktive olur. Bu bağlanma sonradan bağlanır ve GIRK kanalı aktive protein G (G i ve G o) uyarılması neden olur. Bir kez GIRK kanal K hareketi + dışarı daha olumsuz olma potansiyeli istirahat membran neden hücrenin sağlar açtı. Sonuç olarak, nöronlarda GIRK kanal aktivasyon spontan aksiyon potansiyeli oluşumu azalır ve eksitatör nörotransmitterlerin salınımını inhibe eder. Kalbinde, GIRK kanal aktivasyonu böylece kalp hızını yavaşlatan pacemaker aktivitesi inhibe eder. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; GIRK kanal tedavisi nöropatik ağrı, ilaç bağımlılığı, kardiyak aritmiler ve diğer bozukluklar 3 için yeni terapötik ajanların geliştirilmesi için yeni hedefleri temsil eder. Bununla birlikte, bu kanalların farmakoloji büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır. Anti-aritmik ajanlar, antipsikotik ilaçlar ve antidepresan ilaç içeren bir dizi GIRK kanalı bloke rağmen, bu inhibisyon seçici değildir ve nispeten yüksek bir ilaç konsantrasyonlarını 3 meydana gelir. Burada, GIRK kanalların yeni modülatörleri belirlenmesi için bir reel-zamanlı tarama deneyi açıklanmaktadır. Bu deneyde, GIRK kanallar ifade nöronal AtT20 hücreleri, bu tür bis-(1,3-dibutylbarbituric asit) gibi zar potansiyeli hassas boyaların flüoresan ile yüklenir trimethine oxonol [4 DiBAC (3)] ya da HLB 021-152 (Şekil 1 ). Boya molekülleri hücreleri (Şekil 1) içine kuvvetli flüoresan aşağıdaki uptake hale gelir. TedaviGPCR ligandlar olan hücrelerin açmak için GIRK kanallar uyarır. Hücresinin neden K + efflux dışarı daha negatif haline zar potansiyeli ve azaltmak için flüoresan sinyali (Şekil 1) neden olur. Böylece, GIRK kanalı yoluyla K + efflux modüle ilaçlar bir floresan plak okuyucu kullanarak test edilebilir. Diğer iyon kanal tarama testleri gibi atomik absorpsiyon spektrofotometresi 4 veya radyotracer analizi 5 aksine, GIRK kanal fluoresan antikor testi, hızlı, gerçek zamanlı ve ucuz bir tarama prosedürü sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels at JoVE.com

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G-protein bağımlı içe düzeltici K ile etkileşim ilaçların belirlenmesi için gerçek zamanlı tarama yöntemi<sup&gt; +</sup&gt; (GIRK) kanalları açıklanmıştır. Tahlil GIRK kanal aktivitesini ölçmek için membran potansiyeli duyarlı floresan boyalar kullanır. Bu teknik, hücre serileri bir dizi kullanım için uyarlanabilir.

GIRK Kanal Modülatörler belirlenmesi için Floresan Tarama Testi

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Bir Multiplex Antikor Tarama Yöntemi kullanılarak bir Luminex xMAP Tahlil için bir Capture ELISA Dönüşüm

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Bir Proteoliposome Tabanlı effluks Deney Cl Tek-molekül Properties belirleme<sup&gt; -</sup&gt; Kanallar ve Nakliyeciler

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Bir Floresan Gümrükleme Testi kullanarak Zebra balığı Böbrek Fonksiyon Değerlendirilmesi

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...