Name: method for the isolation and identification of mrnas, micrornas and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using rip-chip
Uploaded: 2012-09-29T14:00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip at JoV

وزارة الدفاع (جائزة فكرة W81XWH-07-0406) - لأتاسوي اولوس NIH RO1 A1080870 - لأتاسوي اولوس NIH R21 A1079341 - لأتاسوي اولوس جامعة ميسوري صناديق المؤسسية - لأتاسوي اولوس

<ol>
	<li>Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+HuR+differentially+regulates+unique+subsets+of+mRNAs+in+estrogen+receptor+negative+and+estrogen+receptor+positive+breast+cancer.">The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer.</a> BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).</li><li>Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+RNA+binding+protein+HuR+impairs+tumor+growth+in+triple+negative+breast+cancer+associated+with+deficient+angiogenesis.">Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).</li><li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP-Chip:+the+isolation+and+identification+of+mRNAs,+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts.">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).</li><li>Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonomics:+identifying+mRNA+subsets+in+mRNP+complexes+using+antibodies+to+RNA-binding+proteins+and+genomic+arrays.">Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays.</a> Methods. 26, 191-198 (2002).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+regulatory+analysis+using+en+masse+nuclear+run-ons+and+ribonomic+profiling+with+autoimmune+sera.">Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera.</a> Gene. 317, 79-87 (2003).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).</li><li>Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+RIP-Chip+Analysis.">Advances in RIP-Chip Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).</li><li>de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR.">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).</li><li>de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR:+post-transcriptional+paths+to+malignancy.">HuR: post-transcriptional paths to malignancy.</a> RNA Biol. 2, 11-13 (2005).</li><li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+stability+using+transcription+inhibitors+and+microarrays+reveals+posttranscriptional+control+of+ribosome+biogenesis+factors.">Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors.</a> Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).</li><li>Hieronymus, H., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+RNA-protein+interactions+illustrates+specificity+of+the+mRNA+export+machinery.">Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery.</a> Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).</li><li>Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mRNA+surveillance+is+coupled+to+mRNA+export.">Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export.</a> Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).</li><li>Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Regulatory+Mapping+Indicates+that+the+RNA-Binding+Protein+HuR+Couples+Pre-mRNA+Processing+and+mRNA+Stability.">Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability.</a> Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).</li></ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.

ونظرا لطبيعة هذا التحسين، والتجربة والخبرة تكون مضمونة فقط الطرق للحصول على النتائج المرجوة بنجاح. في العديد من الخطوات من هذا الإجراء، ودرجة الحرارة والمعالجة الفعالة للالكواشف والمنتجات هي ذات أهمية حاسمة. والتخطيط السليم وتنفيذ تقنية مساعدة تأكد من أن تم إجراء التجربة في إطار زمني مناسب في درجات الحرارة المثلى الموصى بها. ومن القضايا الرئيسية مع التجارب العزلة RNA هو حساسية من RNAs إلى تدهور من RNases. جميع الكواشف يجب أن تكون حرة وريبونوكلياز المخزنة أو المستخدمة في ريبونوكلياز خالية الحاويات. هذا هو خطوة حاسمة في ضمان سلامة العينة مرنا الخاص بك. حتى عندما يتم تنفيذ التجربة بشكل صحيح، ومع ذلك، قد لا يمكن تحقيق النتيجة المرجوة نظرا لطبيعة التفاعل بين الممارسات التجارية التقييدية وmRNAs وهدفها. مشكلة واحدة محتملة هو وجود منخفض أو حتى أي إشارة من RNA عزلها تشيب-RIP.على الرغم من أنه قد تكون هناك إشارة من الحمض النووي الريبي مجموع، وهذا قد يكون نتيجة لعدم كفاية البروتين ملزمة يجري سحب من قبل الخرز. الخطوة الأولى هي استكشاف الأخطاء وإصلاحها للتأكد من أن المحللة الخلوية المستخدمة لديها التعبير الكافي للRBP محددة. بعد تأكيد، قد يتم عزل البروتين بعد غسل NT2 النهائي ومعلق في المخزن المؤقت أو آخر Laemmli العازلة المناسبة يبدل طبيعة ويسخن في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ويمكن استخدام تحليل لطخة غربية على هذه العينات المحللة في التنسيق مع المدخلات وكذلك الضوابط السلبية لضمان ما يكفي من هدم للبروتين المرتبطة بها. وعلاوة على ذلك، لأن lysing الخلية هو مطلوب للوصول إلى هذه المكونات، قد يتم عرض إمكانية التفاعلات غير طبيعي وغير المرغوب فيها بين البروتينات وفصلها عادة مرنا. يمكن ربط هذه التفاعلات المحتملة و&quot;امتصاص&quot; mRNAs والهدف الخاص بك أو البروتينات من خلال التفاعلات غير محددة ملزمة. بالإضافة إلى ذلك، شارك في هذه البروتينات متفاوتةيمكن nditions أضعاف في أشكال متعددة والزخارف التي قد تصبح ملزمة لا يمكن الوصول إليها لmRNAs وهدفهم، ومنع تفاعلها. كل من هذه تعزيز أهمية العمل بكفاءة وكذلك الاستفادة من درجات الحرارة المثلى للحد من سرد هذه التفاعلات غير المرغوب فيها. بالإضافة إلى ذلك، سوف الأمثل لغسل الظروف لكل بروتين هدف معين تكون حاسمة لتحقيق أقصى قدر من التفاعل نقاء. قد تكون هناك حاجة غسل ظروف أكثر صرامة. على سبيل المثال، قد يتم استكمال العازلة غسل SDS أو مع مبلغ مناسب من اليوريا للحد من التفاعلات غير محددة والخلفية في الناتج إشارة. سيكون هذا تعتمد اعتمادا كليا على الممارسات التجارية التقييدية في الهدف المجرب وكذلك مرنا الهدف في ظروفها الفسيولوجية فريدة من نوعها. فإن بعض الظروف لا تكون مناسبة لبعض أدوات التحليل مرنا، والتي تجدر الإشارة في إعداد العينات. وأخيرا، على الرغم من RIP ناجحا في إثراء RNARBP-التفاعلات، مشكلة معروفة بشكل جيد مع طريقة (CHIP) RIP هو عدم القدرة على التعرف على مجالات محددة ملزمة للRBP على الأهداف مرنا عابرة. ويمكن استخدام العديد من التقنيات عبر ربط تليها RIP لعزل الأهداف تسلسل فريد، إلا أن استخدام الأشعة فوق البنفسجية قصيرة الموجة يميل إلى أن يؤدي إلى تلف الحمض النووي. وهناك طريقة جديدة تعرف باسم CLIP-PAR، أو photoactivatable يشابك ريبونوكليوزيد وimmuoprecipitation، ويعمل منذ فترة طويلة موجة الأشعة فوق البنفسجية لدمج thiouridine إلى RNA الوليدة السماح تحديد مواقع الربط فريدة من التفاعلات RNA سواء مستقرة وعابرة. وعموما، تم تأسيس RIP-الرقاقة، أداة ممتازة تستخدم لعزل ودراسة التفاعلات بين البروتينات RNA ملزم والأهداف مرنا من خلال مجموعتنا وكذلك العديد من المجموعات البحثية الأخرى. على الرغم من الطبيعة الحساسة في والممارسة، وحسن تنفيذ هذا الإجراء يحقق عزلة هذه المجمعات RNP، التي كانت حتى وقت قريب، كانت inaccessible لاكتشاف وتحليل.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> 1 M dithiothreitol </td><td> الصياد </td><td> BP172-5 </td><td> DTT </td></tr><tr><td> الدناز 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> ريبونوكلياز مجانا </td></tr><tr><td> Ethylendiamine حمض Tetraccetic </td><td> الصياد </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> الجليكوجين </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> سيجما </td><td> H3375-100G </td><td> درجة الحموضة 7.0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M بوكل </td><td> الصياد </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> الصياد </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 العازلة </td><td> * انظر أدناه </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polysome يزيس العازلة </td><td> * انظر أدناه </td><td></td><td></td></tr><tr><td> أقراص البروتيني المثبط كوكتيل </td><td> روش </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> البروتين A sepharose و الخرز </td><td> سيجما </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> بروتين K </td><td> الصياد </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> ريبونوكلياز المانع خارج ريبونوكلياز </td><td> إينفيتروجن </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / ميكرولتر </td></tr><tr><td> 1 M كلوريد الصوديوم </td><td> الصياد </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> كبريتات الصوديوم دوديسيل </td><td> الصياد </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك </td><td> الصياد </td><td&gt; BP153-500 </td><td> درجة الحموضة 7.4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> مجمعات ريبونوكليوزيد Vanadyl </td><td> مختبرات نيو إنجلاند </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف Workup </td></tr><tr><td> إعداد الكواشف في ريبونوكلياز / الدناز الحرة، DEPC المعالجة الأواني الزجاجية </td></tr><tr><td> Polysome تحلل العازلة </td></tr><tr><td> 100 ملي مول بوكل </td></tr><tr><td> 5 ملم MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 HEPES ملي (الرقم الهيدروجيني 7.0) </td></tr><tr><td> 0.5٪ NP40 </td></tr><tr><td> 1 ملم DTT </td></tr><tr><td> 100 وحدة / مل ريبونوكلياز المغادرة </td></tr><tr><td> 400 ميكرومتر VRC </td></tr><tr><td> قرص البروتيني المثبط كوكتيل </td></tr><tr><td> 5 مل من العازلة تحلل Polysome </td></tr><tr><td> إضافة 50 ميكرولتر من HEPES M 1 (درجة الحموضة 7.0) </td></tr><tr><td> 500 ميكرولتر من KCL M 1 </td></tr><tr><td> سعة 25 ميكرولتر من MgCl M 1 2 </td></tr><tr><td> سعة 25 ميكرولتر من NP40 </td></tr><tr><td> 4،7 مل ريبونوكلياز الدناز خالية H 2 O </td></tr><tr><td> 50 ميكرولتر من DTT M 1 </td></tr><tr><td> 12،5 ميكرولتر من 100 U / مل ريبونوكلياز المغادرة </td></tr><tr><td> 200 ميكرولتر كوكتيل مثبط البروتياز (المنحلة وفقا لالصانع) </td></tr><tr><td> 10 ميكرولتر 200 ملي مول VRC (في وقت الاستخدام) </td></tr><tr><td> NT2 العازلة </td></tr><tr><td> 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.4) </td></tr><tr><td> 150 مم كلوريد الصوديوم </td></tr><tr><td> 1 ملم MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0.05٪ NP40 </td></tr><tr><td> 1 L من الاحتياطي NT2 </td></tr><tr><td> 50 مل تريس (درجة الحموضة 7.4) </td></tr><tr><td> 30 مل 5 M كلوريد الصوديوم </td></tr><tr><td> 1 مل 1 M MgCl <suب&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 ميكرولتر NP40 </td></tr><tr><td> 820 مل ريبونوكلياز الدناز خالية H 2 O </td></tr></tbody></table>

method for the isolation and identification of mrnas, micrornas and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using rip-chip

نتيجة لتطور الإنتاجية العالية وكفاءة تحليل تسلسل ميكروأري، أصبحت عالمية تحليل التعبير الجيني شكل سهلة ومتاحة بسهولة لجمع البيانات. في مجال البحوث والنماذج كثيرة المرض غير أن مستويات ثابتة من الدولة مرنا الجينات المستهدفة دائما لا ترتبط مباشرة مع ثابت مستويات البروتين الدولة. بعد النسخي تنظيم الجينات هو التفسير المحتمل لاختلاف بين الاثنين. مدفوعا من البروتينات ملزمة RNA ملزم (RBP)، بعد النسخي التنظيم مرنا يؤثر التوطين والاستقرار والترجمة من خلال تشكيل بروتين نووي ريبوزي (RNP) المعقدة مع mRNAs والهدف. تحديد هذه مرنا غير معروف نوفو دي من الأهداف مقتطفات الخلوية في مجمع RNP محورية لفهم آليات ومهام RBP وتأثيرها على الإنتاج مما أدى البروتين. هذا البروتوكول يحدد طريقة تسمى RNP مناعي-ميكروأري (RIP-رقاقة)، ​​والذي يسمح لتحديد من لياليmRNAs وpecific المرتبطة في مجمع بروتين نووي ريبوزي، في ظل الظروف التجريبية المتغيرة، جنبا إلى جنب مع مزيد من الخيارات لتحسين تجربة للباحث على حدة. مع هذه الأداة التجريبية الهامة، يمكن للباحثين استكشاف الآليات المعقدة المرتبطة تنظيم الجينات في مرحلة ما بعد النسخي وكذلك التفاعلات بروتين نووي ريبوزي أخرى.

Watch this Scientific Journal Video about Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip at JoV

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

A خطوة خطوة لعزل بروتوكول وتحديد مجمعات RNA المرتبطة بها من خلال رقاقة-RIP.

طريقة لعزل وتحديد من microRNAs، وmRNAs ومكونات البروتين من بروتين نووي ريبوزي مجمعات من مقتطفات خلية باستخدام رقاقة RIP

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

إعداد والتقطير من البيض مقتطفات القيطم المورق

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

تنقية والتخيل من الأنفلونزا من المجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسية

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

تحديد بروتين المجمعات مع كمية البروتينات في البيرة س.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

تحديد وتوصيف ارتباط بالغليكوزيل باستخدام بروتين معين إندو وexoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

العزلة من الدم والأوعية المشتقة متعددة القدرات السلائف من العضلات الهيكلية البشرية

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

رسم الخرائط على أساس فؤاد للخصائص مطاطا جدران الخلايا: في الأنسجة، الخلوية، وقرارات التحت خلوية

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

إجراءات لتقييم كفاءة المرسب لإزالة فرقت الجسيمات من المستخلصات النباتية

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...