Name: method for the isolation and identification of mrnas, micrornas and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using rip-chip
Uploaded: 2012-09-29T14:00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip at JoV

Department of Defense (Idea Award W81XWH-07-0406) - Til Ulus Atasoy NIH RO1 A1080870 - Til Ulus Atasoy NIH R21 A1079341 - Til Ulus Atasoy University of Missouri institutionelle fonde - Til Ulus Atasoy

Eksperiment forberedelse Før du starter eksperiment, er det afgørende at have alle reagenser, containere og redskaber RNase fri. Behandling af glasvarer med RNase inhibitor (RNaseZAP, Ambion), efterfulgt af skylning med DEPC-behandlet vand. Sørg for, at alle reagenser er bekræftet som RNase fri. 1. Forbered mRNP Lysate <ol><li> Dyrke og høste eksponentielt voksende vævsceller at producere mellem 2-5 mg totalt protein for hver RIP. <ol class="lalpha"><li> To P150 dyrkningsskåle er normalt tilstrækkelig. </li><li> For hver RBP genstand for efterforskning, skal de samlede cellulære antal og protein beløb optimeres for at maksimere passende mål mRNA og RBP interaktioner. </li><li> RIP for qRT-PCR-analyse kan kræve mindre cellulært lysat (ca. 400 ug total protein) på grund af dens amplifikation og påvisning fremgangsmåde specielt egnet til høje tæthed RBPs såsom Hur, AUF1, TIAR. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Pellet celler via centrifugering ved 200 x g i 8-10 min ved 4 ° C, derefter vaskes tre gange med iskoldt PBS. </li><li> Efter slutvask, svippe forsigtigt bunden af ​​røret og resuspender cellepellet i lige store volumener af tilberedt polysom ​​lysispuffer (PLB) med RNase og protease-inhibitorer. <ol class="lalpha"><li> Det anbefales at måle den nøjagtige mængde cellepellet. </li></ol></li><li> Forsigtigt pipette blandingen (ikke vortex) at gå i opløsning klumper af celler og inkuberes lysat på is i 5 min. </li><li> Der centrifugeres ved 13.000 x g i 20 minutter ved 4 ° C for at fjerne lysatet af efterladenskaber. </li><li> Straks overføre klarede supernatant til forud kølet mikrofugerør. </li><li> Hold på is og opbevares ved -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Frysning fuldender den korrekte lyse af cellerne og forhindrer uønsket binding. Fortsæt med RIP umiddelbart efter prøve tø og opbevare prøver på is for at undgå RNA-nedbrydning. &lt;/ Li&gt; <li> Dette lysat kan opbevares i op til seks måneder ved -80 ° C. Undgå gentagne fryse-tø cyklusser, da dette kan føre til protein og / eller mRNA-nedbrydning. </li></ol></li><li> Kvantificering af proteinkoncentration i lysat under anvendelse af standard Bradford protein assay. </li></ol> 2. Coat protein A-sepharosekugler med antistof og vask <ol><li> Pre-swell protein A Sepharose (PAS) perler natten over i NT2-puffer (3-4 volumener) med 5% BSA. Opbevares ved 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Langtidsopbevaring af op til flere måneder ved 4 ° C er muligt, når suppleret med 0,1% natriumazid. </li><li> Protein sepharoseperler bør vælges på grundlag af isotype af target RBP antistof. Proteiner A, G og A / G alle har specifikke isotype mål og varierer i mål affinitet. Protein A-sepharosekugler blev anvendt baseret på isotype specificitet og affinitet for how protein antistof. </li></ol></li><li> Før brug fjernes det overskydende NT2 buffer, såat de endelige perler til buffer forholdet er 1:1. </li><li> Ved hjælp af 1,5 ml RNAse-fri mikrocentrifugerør, fjernes 100 ul PAS opslæmning tilsættes 30 ug antistof for hver enkelt IP-reaktion (dvs. specifik RBP og isotypekontrol). </li><li> Tilsættes 100-200 ml NT2 puffer til antistof bead mix. <ol class="lalpha"><li> Blandingen kan opbevares i flere uger ved 4 ° C, når suppleret med 0,1% natriumazid. </li><li> Et isotype-matchet antistof eller helt normale sera fra samme art bør anvendes parallelt som antistofkontrol mod baggrunden RNA. </li></ol></li><li> Tilføje passende antistof til perle Bland og inkuber natten over, tumbling ende over ende ved 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Optimere antistoftiter for specifikke protein, som undersøges (1, 5, 10 eller 30 ug antistof er normalt tilstrækkeligt). </li></ol></li><li> Fremstille antistof-belagte kugler umiddelbart før brug ved vask med 1 mliskold NT2 buffer 5 gange. <ol class="lalpha"><li> Vask bead mix ved centrifugering ved 13.000 x g i 1-2 min ved 4 ° C. </li><li> Fjern forsigtigt den maksimale mængde supernantant med hånd pipettor eller aspirator men vær omhyggelig med at undgå at forstyrre pellet. </li><li> Vask til fjernelse af ubundet antistof og RNase kontaminanter fra antistof-blandingen. </li></ol></li><li> Når den sidste vask er fuldført, resuspendere perlerne i 700 pi iskold NT2-puffer efterfulgt af behandling med forskellige RNase-inhibitorer til beskyttelse af mål-mRNA&#39;er, herunder 10 pi RNase ved 40 U / ul, 10 ul 100 mM DTT og 15 pi EDTA (15 mM). Bring volumen til 1000 ul med NT2-puffer. <ol class="lalpha"><li> Vanadyl ribonukleosid komplekser ikke anvendes på grund af hæmmende virkning af EDTA. </li></ol></li></ol> 3. Immunopræcipitation og RNA Precipitation <ol><li> Valgfri præclearen Step:<ol class="lalpha"><li> For at reducere baggrunden, kan perler og kontrol-antistof anvendes til at for-klare lysat. Dette kan reducere signal i udgangssignalet. </li><li> Dette trin kan være nødvendigt at reducere baggrunden, når du laver IP efterfulgt af microarray. Det er generelt ikke nødvendigt for IP efterfulgt af qRT-PCR. </li><li> Præclear med 15 ug isotypekontrol i 30 min / 4 ° C tumbling ende over ende. </li><li> Der tilsættes 50 ul preswollen PAS perler ikke-coatede med antistoffet fra trin 2.1. </li><li> Inkuber 30 min / 4 ° C med rotation ende over ende </li><li> Centrifuger ved 10.000 x g ved 4 ° C. Gem supernatant for IP. </li></ol></li><li> Tilsæt 100 pi af isolerede klaret lysat (ca. 2-5 mg) til tilberedt antistof mix. <ol class="lalpha"><li> Fortynding lysat vil bidrage til at reducere baggrund og ikke-specifik binding. </li><li> Mængden af ​​lysat input kan variere afhængigt af påvisningsfremgangsmåde og tæthed RBP or effektivitet RBP antistoffet som noterede i trin 1.1.c. </li></ol></li><li> (Valgfrit) straks blandes røret ved forsigtigt at svippe adskillige gange efterfulgt af kort centrifugering ved 10.000 x g ved 4 ° C for at pelletere kuglerne og straks fjernes 100 ul af supernatanten som et samlet input mRNA repræsentation for qPCR analyse under anvendelse af standard-RNA-isoleringsteknikker. <ol class="lalpha"><li> Dette trin er at bekræfte, at input lysat RNA er optimal for IP og bør kun udføres som en check trin eller som et fejlfindingstrin efter RIP med dårlige RNA resultater. </li></ol></li><li> Wrap røret i parafilm at sikre tæthed og inkuber ved 4 ° C i 2-4 timer, tumbling ende over ende. <ol class="lalpha"><li> Timing på inkubation bør optimeres baseret på mål overflod og bør minimeres for at undgå komplekse omlejring eller nedbrydning. For nogle RBPs kortere inkubationer kan være mere optimale. </li></ol></li><li> Pellet perlerne ved 5000 xgfeller 5 min ved 4 ° C og gem supernatanten for potentielle analyse ved Western blot. Opbevar portioner ved -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Delprøver af supernatant med høje mængder af tilbageværende målprotein kan indikere en fejl i proteinet, der skal udfældes ved sepharoseperler. </li></ol></li><li> Som tidligere beskrevet, vaskes perlerne 5 gange med 1 ml iskold NT2 puffer og centrifugering (5.000 x g i 5 minutter ved 4 ° C) og fjern supernatanten med hånden pipettor eller en aspirator. <ol class="lalpha"><li> Strengere vask fremgangsmåder kan anvendes for at reducere baggrund ved at supplere NT2-puffer med natriumdeoxycholat, urinstof eller SDS. </li><li> Opbevare prøver på is så meget som muligt og arbejder hurtigt at minimere nedbrydning af mål-mRNA. </li></ol></li><li> Valgfrit: Gem en lille portion (10%) af perler blandes eller køre en ekstra prøve sideløbende til kontrol af IP effektiviteten af ​​målprotein ved anvendelse af Western blot-analyse.</li></ol> 4. DNase og proteinase K Behandlinger <ol><li> Efter vask suppleret resuspendere perlerne med 100 ul NT2-puffer med 5 pi RNase-fri DNase 1 (2 U / ul). </li><li> Opbevar ved 37 ° C i 5-10 min. Tilsæt 1 ml af NT2-puffer og centrifugeres ved 5.000 x g i 1 min ved stuetemperatur. <ol class="lalpha"><li> En lille (~ 10%) alikvot af perler kan anvendes til at kontrollere IP effektivitet ved SDS-PAGE analyse. </li></ol></li><li> Resuspender PAS pellet i 100 ul NT2-buffer, 5 pi proteinase K (10 mg / ml), og 1 pi 10% SDS. </li><li> Inkubér resuspenderede perleblandingen i 30 minutter ved 55 ° C i et vandbad, forsigtigt flicking på hver 10 min. <ol class="lalpha"><li> Proteinase K vil hjælpe til med frigivelse af RNP-komponenter. </li></ol></li><li> Pellet perlerne ved 5000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT) og indsamle supernatanten (~ 100 ul). </li><li> Tilsæt 200 pi NT2 puffer til perler, centriFuge 5000 x g i 2 minutter ved stuetemperatur, samle bundfald (~ 200 ul), og kassér perler. </li><li> Kombiner supernatanter (100 pi og 200 ul), og der tilsættes 300 gl nedre lag af syre phenol-CHCI3. </li><li> Vortex, 1 min RT (eller 37 ° C i shaker) og centrifugeres ved 16.000 x g ved stuetemperatur i 1 min. </li><li> Opsamles 250 ul øvre lag (ikke forstyrrer interface), der tilsættes 25 ul natriumacetat ved pH 5,2, 625 pi 100% ETOH og 5 ul glycoblue, og bland godt. </li><li> Opbevares natten over ved -20 ° C. <ol class="lalpha"><li> For at sikre korrekt genvinding af RNA, vil tilsætning af glycoblue øge synligheden af ​​RNA-pellet ved at virke som et bærermolekyle. </li></ol></li><li> Den følgende dag blandes rør ved inversion 3-5 gange, centrifugering ved 12.000 x g ved 4 ° C i 30 minutter og kasser supernatanten. </li><li> Tilsæt 1 ml 70% ETOH til den blå pille og blandes ved at vende eller vortexing. </li><li> Centrifuger 12.000 x g ved 4 ° C i 2 min. </li><li> Discard supernatanten og centrifugeres 12.000 x g i 1 min ved 4 ° C. </li><li> Fjerne enhver resterende 70% EtOH med en pipette og lufttørre pellet ved stuetemperatur i 5 minutter. </li><li> Resuspender i 20-40 pi RNase / DNase-frit vand eller en anden passende volumen efter behov. <ol class="lalpha"><li> Prøven er nu klar til yderligere efterfølgende anvendelser såsom qRT-PCR eller microarray. </li><li> Nanodrop spektrofotometri kan anvendes til at vurdere prøvekoncentrationen, men med værdifulde prøver, kan det være fordelagtigt at undgå nanodropping prøver som det kan være uøkonomiske og forholdsvis upræcis. Vi foreslår normalisere prøver til husholdning gentranskripter at vurdere renhed og IP effektivitet for ædle eller lavt udbytte prøver. </li></ol></li></ol> 5. Repræsentative resultater Hvis proceduren er optimeret og udføres korrekt, bør immunoprecipitation give en betydelig berigelse af mRNA mål. Typisk, Afhængigt af RBP og dets mRNA target (s), ser vi berigelse på omtrent 10 - til 50 gange, når vurderet ved qRT-PCR. Mange mål for RBPs kan opdages i massevis ved hjælp af microarray-analyse. Men denne metode er mere følsom for nedbrydning sammenlignet med qRT-PCR. Afhængigt af RBP, antallet af mål og effektiviteten af ​​reaktionen kan microarray afsløre hundredvis af nye targets, eller det kan kun afsløre et par stykker, hvis nogen. For eksempel, en af de bedre karakteriseret RNA-bindende proteiner how post-transkriptionelt regulerer ekspression og translation af mange vigtige fysiologiske gener 1, 2. Isolering af Hur-ribonucleo-komplekset via RIP-Chip i brystcancercellelinjer, f.eks viste berigelse af flere vigtige kendte Hur mål, herunder β-actin med qRT-PCR, som vist i figur 1.. I begge cancercellelinjer β-actin er beriget 12 - til 15-fold. Typisk, når udført korrekt vi se en betydelig Enrichment af β-actin i en række forskellige cellelinier. Men hvis RIP ikke afslører nogen signifikant berigelse for β-actin indikerer dette et problem med RIP og proceduren kan være nødvendigt at blive gentaget. Endvidere microarray analyse af immunpræcipiterede prøver fra disse cellelinier afslørede særskilte ekspressionsvektorer delmængder af Hur mål i forskellige østrogen-receptor (ER) positive MCF-7 cancerceller versus ER negative MB-231 brystcancercellelinjer som vist i figur 2 1. Disse mål falder i flere kategorier: kendte og ukendte HUR mål, som enten var forbundet eller ikke forbundet med kræft. For eksempel er CALM2 og CD9 begge kræftgener som ikke tidligere er identificeret som Hur mål. Ved hjælp af mikroarray og bekræfter med qRT-PCR, CALM2 og CD9 blev fundet at være 5 - til 180-fold beriget med how pellet viser en fremtrædende interaktion mellem Hur protein og disse målgener. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg&quot; alt = &quot;Figur 1&quot; /&gt; Figur 1. Immunopræcipitation og RIP i MB-231 (ER-) og MCF-7 (ER +) brystcancerceller. Immunopræcipitationer blev udført fra MB-231 eller MCF-7-cellelysater under anvendelse af anti-Hur monoklonalt antistof (3A2) og IgG1-isotypekontrol. A. IP Western Hurs afslørede forventede størrelse band som påvist ved 3A2. Panel om højre afslører mængder af HUR i input lysater bruges fra begge cellelinier, med β-tubulin som en belastning kontrol. B. Kontrol af kvantitativ RT-PCR viste femten-og elleve-fold berigelser af β-actin, en kendt HUR mål, i de 3A2 VP fra MB-231 og MCF-7 hhv. Alle ΔΔCT værdier blev normaliseret til GAPDH. Forsøg blev udført in duplo (n = 2). <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. HUR RIP-CHIP identificerer forskellige genetiske profiler i ER + og ER-brystkræftceller.How immunopræcipitationer blev udført fra MB-231 eller MCF-7 cellelysater ved hjælp Hur antistof og IgG1-isotypekontrol hybridiseret til Illumina Sentrix arrays (47000-gener). Styresignaler blev subtraheret. Resultater repræsenterer kumulative data fra 12 forskellige arrays. Eksperimenter blev udført tre gange (n = 3) for hver cellelinje med matchende kontroller. Skalaer er log2.

<ol>
	<li>Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+HuR+differentially+regulates+unique+subsets+of+mRNAs+in+estrogen+receptor+negative+and+estrogen+receptor+positive+breast+cancer.">The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer.</a> BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).</li><li>Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+RNA+binding+protein+HuR+impairs+tumor+growth+in+triple+negative+breast+cancer+associated+with+deficient+angiogenesis.">Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).</li><li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP-Chip:+the+isolation+and+identification+of+mRNAs,+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts.">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).</li><li>Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonomics:+identifying+mRNA+subsets+in+mRNP+complexes+using+antibodies+to+RNA-binding+proteins+and+genomic+arrays.">Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays.</a> Methods. 26, 191-198 (2002).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+regulatory+analysis+using+en+masse+nuclear+run-ons+and+ribonomic+profiling+with+autoimmune+sera.">Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera.</a> Gene. 317, 79-87 (2003).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).</li><li>Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+RIP-Chip+Analysis.">Advances in RIP-Chip Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).</li><li>de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR.">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).</li><li>de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR:+post-transcriptional+paths+to+malignancy.">HuR: post-transcriptional paths to malignancy.</a> RNA Biol. 2, 11-13 (2005).</li><li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+stability+using+transcription+inhibitors+and+microarrays+reveals+posttranscriptional+control+of+ribosome+biogenesis+factors.">Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors.</a> Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).</li><li>Hieronymus, H., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+RNA-protein+interactions+illustrates+specificity+of+the+mRNA+export+machinery.">Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery.</a> Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).</li><li>Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mRNA+surveillance+is+coupled+to+mRNA+export.">Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export.</a> Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).</li><li>Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Regulatory+Mapping+Indicates+that+the+RNA-Binding+Protein+HuR+Couples+Pre-mRNA+Processing+and+mRNA+Stability.">Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability.</a> Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

På grund af karakteren af ​​dette eksperiment, optimering og erfaring vil være de eneste garanterede måder at kunne tilegne sig de ønskede resultater. I mange trin i denne procedure, er temperaturen og effektiv håndtering af reagenserne og produkterne kritisk vigtighed. Korrekt planlægning og udførelse af teknik vil hjælpe forsikre, at forsøget blev udført i et passende tidsrum ved de optimale anbefalede temperaturer. Et stort problem med RNA-isolering eksperimenter er følsomheden af ​​RNA&#39;er for nedbrydning af RNaser. Alle reagenser skal være RNase fri og opbevaret eller anvendt i RNase-fri beholdere. Dette er et kritisk skridt til at sikre integriteten af ​​din mRNA prøve. Selv når forsøget udføres korrekt, men den ønskede resultat ikke opnås på grund af beskaffenheden af ​​interaktionen mellem RBP og dens target mRNA. Et potentielt problem er at have ringe eller slet ingen signal fra RNA isoleret ved RIP-Chip.Selvom der kan være signalet fra total RNA, kan dette være resultatet af utilstrækkeligt bindingsprotein trækkes ned af perlerne. Det første trin i proceduren er at bekræfte, at det cellulære lysat at der er tilstrækkelig ekspression af den specifikke RBP. Ved godkendelse, kan proteinet isoleres efter den endelige NT2 vask og resuspenderet i Laemmli-buffer eller en anden passende denaturerende puffer og opvarmet til 95 ° C i 5 min. Western blot-analyse kan anvendes på disse prøver i koordination med input-lysat og negative kontroller for at sikre tilstrækkeligt træk ned af associeret protein. På grund lysering af cellen for at få adgang disse komponenter, kan muligheden for unormale og uønskede interaktioner mellem normalt separerede proteiner og mRNA indføres. Disse interaktioner kan potentielt binde og &quot;opsuge&quot; dit mål mRNA&#39;er eller bindingsproteiner gennem uspecifikke interaktioner. Desuden mister proteiner i disse varierende cold kan folde i flere varianter og deres bindingsmotiver kan blive utilgængelige for deres mål mRNA&#39;er, forhindrer deres samspil. Begge disse styrker vigtigheden af ​​at arbejde effektivt og under anvendelse af de optimale temperaturer anført for at begrænse disse uønskede interaktioner. Derudover vil optimering af vaskebetingelser for hvert specifikt målprotein være kritisk for at maksimere renheden af ​​interaktionen. Strengere vaskebetingelser kan være nødvendig. For eksempel kan vaskepufferen suppleres med SDS eller en passende mængde urinstof for at reducere ikke-specifikke interaktioner og baggrund i signaludgang. Dette vil være fuldstændig afhængig af eksperimentatoren mål RBP og mål-mRNA&#39;et i deres unikke fysiologiske betingelser. Nogle forhold vil ikke være egnet til visse mRNA analyseværktøjer, der skal bemærkes i forberedelsen af ​​prøver. Endelig, selvom RIP er en succes i berigelse af RNA-RBP interaktioner, et velkendt problem med RIP (CHIP) metode er den manglende evne til at identificere de specifikke bindende domæner af RBP på de forbigående mRNA mål. Flere tværbindende teknikker kan anvendes efterfulgt af RIP at isolere unik sekvens mål, men brugen af ​​kortbølge UV tendens til at føre til nukleinsyre skade. En ny metode, der kaldes PAR-CLIP, eller fotoaktiverbart ribonucleosid tværbinding og immuoprecipitation, beskæftiger langbølge UV at indarbejde thiouridine i spirende RNA muliggør identifikation af unikke bindingssteder fra både stabile og forbigående RNA interaktioner. Samlet set har RIP-Chip blevet etableret som et udmærket redskab til at isolere og undersøge samspillet mellem RNA-bindende proteiner og deres mRNA mål af vores gruppe samt mange andre forskergrupper. Selvom følsomme karakter og praksis, vil en korrekt gennemførelse af denne procedure giver isolering af disse RNP komplekser, som indtil for nylig har været inaccessible for opdagelse og analyse.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn reagens </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 1 M dithiothreitol </td><td> Fisher </td><td> BP172-5 </td><td> DTT </td></tr><tr><td> DNase 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNase fri </td></tr><tr><td> Ethylendiamin Tetraccetic Acid </td><td> Fisher </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> Glykogen </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td><td> pH 7,0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78.641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCI </td><td> Fisher </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl2 </td><td> Fisher </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td><td> * Se nedenfor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polysom ​​Lysis Buffer </td><td> * Se nedenfor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Proteasehæmmere cocktail tabletter </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> Protein A-sepharosekugler </td><td> Sigma </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Fisher </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Out RNase inhibitor </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / ul </td></tr><tr><td> 1 M NaCI </td><td> Fisher </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat </td><td> Fisher </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> Fisher </td><td&gt; BP153-500 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Vanadyl ribonucleosid Komplekser </td><td> New England Labs </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens Oparbejdning </td></tr><tr><td> Fremstille reagenser i RNase / DNase-free, DEPC-behandlet glasvarer </td></tr><tr><td> Polysom ​​lyseringsbuffer </td></tr><tr><td> 100 mM KCI </td></tr><tr><td> 5 mM MgCI2 </td></tr><tr><td> 10 mM HEPES (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 0,5% NP40 </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 100 enheder / ml RNase Out </td></tr><tr><td> 400 um VRC </td></tr><tr><td> Protease inhibitor cocktail tablet </td></tr><tr><td> 5 ml polysom ​​lysispuffer </td></tr><tr><td> Der tilsættes 50 ul 1 M HEPES (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 500 pi 1 M KCL </td></tr><tr><td> 25 ul 1 M MgCl2 </td></tr><tr><td> 25 ul NP40 </td></tr><tr><td> 4,7 ml RNase-DNase-fri H2O </td></tr><tr><td> 50 ul 1 M DTT </td></tr><tr><td> 12,5 ul 100 U / ml RNase Out </td></tr><tr><td> 200 gl proteasehæmmer cocktail (opløst efter fabrikanten) </td></tr><tr><td> 10 pi 200 mM VRC (ved brugstidspunktet) </td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCI (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 150 mM NaCI </td></tr><tr><td> 1 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 0,05% NP40 </td></tr><tr><td> 1 L af NT2 Buffer </td></tr><tr><td> 50 ml Tris (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 30 ml 5 M NaCl </td></tr><tr><td> 1 ml 1 M MgCl <sub&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 pi NP40 </td></tr><tr><td> 820 ml RNase-DNase-fri H2O </td></tr></tbody></table>

method for the isolation and identification of mrnas, micrornas and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using rip-chip

Som følge af udviklingen af ​​high-throughput sekventering og effektiv microarray analyse er den globale genekspressionsanalyse blevet en nem og let tilgængelig form for dataindsamling. I mange forsknings-og sygdomsmodeller imidlertid ligevægtsniveauer af målgen mRNA ikke altid direkte korrelerer med steady state proteinniveauer. Post-transkriptionel genregulering er en sandsynlig forklaring på divergensen mellem de to. Drevet af bindingen af ​​RNA-bindende proteiner (RBP), post-transkriptionel regulering påvirker mRNA lokalisering, stabilitet og translation ved at danne et ribonukleoprotein (RNP)-kompleks med target mRNA. Identifikation disse ukendte de novo mRNA mål fra cellulære ekstrakter i RNP komplekset er afgørende for forståelsen mekanismer og funktioner RBP og den deraf følgende effekt på protein output. Denne protokol skitserer en metode kaldet RNP immunopræcipitation-microarray (RIP-Chip), som giver mulighed for at identificere sÆRLIGE mRNA&#39;er inddrages i ribonucleoprotein kompleks, under skiftende forsøgsbetingelser sammen med muligheder for yderligere at optimere et eksperiment for den enkelte forsker. Med dette vigtige eksperimentelle værktøj, kan forskerne undersøge de indviklede mekanismer, der er forbundet med post-transkriptionel genregulering samt andre ribonukleoprotein interaktioner.

Watch this Scientific Journal Video about Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip at JoV

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

En trin for trin-protokollen til at isolere og identificere RNA associerede komplekser gennem RIP-Chip.

Fremgangsmåde til isolering og identifikation af mRNA&#39;er, microRNA og proteinkomponenter af ribonucleoprotein komplekser fra celleekstrakter ved hjælp af RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Identifikation og karakterisering af protein glycosylation bruge specifikke endo-og exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifikation af protein-komplekser i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjælp Sekventiel Peptide Affinitetsrensning i kombination med Tandem massespektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifikation af post-translationelle modifikationer til planteprotein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolering af blod-fartøj-afledt Multipotente Forstadier fra human skeletmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

AFM-baserede Kortlægning af de elastiske egenskaber af cellevægge: ved Tissue, Cellular, og Subcellulære resolutioner

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Procedure for at vurdere effektiviteten af ​​flokkuleringsmidler til fjernelse af dispergerede partikler fra planteekstrakter

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...