Name: method for the isolation and identification of mrnas, micrornas and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using rip-chip
Uploaded: 2012-09-29T14:00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip at JoV

Министерство обороны (Идея премии W81XWH-07-0406) - Чтобы улуса Atasoy NIH RO1 A1080870 - Для улуса Atasoy NIH R21 A1079341 - Для улуса Atasoy Университет Миссури институциональных фондов - Для улуса Atasoy

<ol>
	<li>Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+HuR+differentially+regulates+unique+subsets+of+mRNAs+in+estrogen+receptor+negative+and+estrogen+receptor+positive+breast+cancer.">The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer.</a> BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).</li><li>Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+RNA+binding+protein+HuR+impairs+tumor+growth+in+triple+negative+breast+cancer+associated+with+deficient+angiogenesis.">Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).</li><li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP-Chip:+the+isolation+and+identification+of+mRNAs,+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts.">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).</li><li>Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonomics:+identifying+mRNA+subsets+in+mRNP+complexes+using+antibodies+to+RNA-binding+proteins+and+genomic+arrays.">Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays.</a> Methods. 26, 191-198 (2002).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+regulatory+analysis+using+en+masse+nuclear+run-ons+and+ribonomic+profiling+with+autoimmune+sera.">Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera.</a> Gene. 317, 79-87 (2003).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).</li><li>Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+RIP-Chip+Analysis.">Advances in RIP-Chip Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).</li><li>de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR.">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).</li><li>de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR:+post-transcriptional+paths+to+malignancy.">HuR: post-transcriptional paths to malignancy.</a> RNA Biol. 2, 11-13 (2005).</li><li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+stability+using+transcription+inhibitors+and+microarrays+reveals+posttranscriptional+control+of+ribosome+biogenesis+factors.">Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors.</a> Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).</li><li>Hieronymus, H., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+RNA-protein+interactions+illustrates+specificity+of+the+mRNA+export+machinery.">Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery.</a> Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).</li><li>Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mRNA+surveillance+is+coupled+to+mRNA+export.">Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export.</a> Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).</li><li>Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Regulatory+Mapping+Indicates+that+the+RNA-Binding+Protein+HuR+Couples+Pre-mRNA+Processing+and+mRNA+Stability.">Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability.</a> Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).</li></ol>

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие интересы.

Из-за природы этого эксперимента, оптимизации и опыт будет гарантирована только способы успешного приобретения желаемых результатов. Во многих шагов этой процедуры, температуры и эффективной обработки реагентов и продуктов являются критически важными. Правильное планирование и выполнение техника поможет гарантировать, что эксперимент был проведен в приемлемые сроки при оптимальных температурах рекомендуется. Главная проблема с экспериментами выделения РНК является чувствительность РНК к деградации РНКазы. Все реагенты должны быть РНКазы свободной и хранятся или используются в РНКазы контейнеров. Это очень важный шаг в обеспечении целостности вашей мРНК образца. Даже тогда, когда эксперимент проводится должным образом, однако, желаемого результата не может быть достигнуто за счет характера взаимодействия между РСП и его мРНК мишени. Одна потенциальная проблема с низкой или даже нет сигнала от РНК выделяли RIP-Chip.Хотя может быть сигнал от общей РНК, это может быть результатом недостаточной связывающего белка тянут вниз бисером. На первом этапе устранения неполадок, чтобы подтвердить, что клеточная лизат используется имеет адекватного выражения конкретных ОДП. После подтверждения, белок может быть выделен после окончательного NT2 стирки и ресуспендировали в Laemmli буфера или другого соответствующего денатурирующих буфера и нагревали при 95 ° C в течение 5 мин. Вестерн-блот анализ может быть использован на этих образцов в координации с входом лизат, а также отрицательного контроля для обеспечения достаточного тянуть вниз связанные белка. Кроме того, поскольку лизис клетки, необходимые для доступа к этим компонентам, потенциал для ненормальных и нежелательных взаимодействий между обычно разделенных белков и мРНК могут быть введены. Эти взаимодействия потенциально могут связываться и &quot;впитывать&quot; вашей целевой мРНК или белков через неспецифические взаимодействия. Кроме того, белки в этих различных сотрудничествеnditions можно сложить в несколько вариаций и их связывающие мотивы могут стать недоступными для своей целевой мРНК, предотвращая их взаимодействия. Оба эти укрепления важность эффективной работы, а также использования оптимальных температур перечисленных ограничить эти нежелательные взаимодействия. Кроме того, оптимизация стиральная условий для каждого конкретного белка-мишени будет иметь решающее значение для максимальной чистоты взаимодействия. Более жесткие условия стиральных могут быть необходимы. Например, промывочный буфер может быть дополнен SDS или соответствующее количество мочевины для уменьшения неспецифического взаимодействия и фон в выходной сигнал. Это будет полностью зависят от целевой экспериментатора RBP, а также целевой мРНК в их уникальных физиологических условий. Некоторые условия не будут пригодны для определенных мРНК инструментов анализа, которые должны быть отмечены в подготовке образцов. Наконец, хотя RIP является успешным в обогащении РНК-RBP взаимодействия, известные проблемы с RIP (CHIP) метода является невозможность определить конкретные связывающие домены RBP на переходном цели мРНК. Несколько сшивания методы могут быть использованы следуют RIP выделить уникальную последовательность целей, однако использование коротковолнового ультрафиолетового правило, приводит к повреждению нуклеиновых кислот. Новый метод, известный как PAR-CLIP или фотоактивируемых сшивания рибонуклеозид и immuoprecipitation, работает длинноволнового ультрафиолетового включить тиоуридина в зарождающейся РНК, позволяющий идентифицировать уникальные сайты связывания с обеих стабильные и переходные взаимодействия РНК. В целом, RIP-Chip была создана как отличный инструмент, используемый для выделения и изучения взаимодействия РНК-связывающих белков и их цели мРНК нашей группы, а также многих других исследовательских групп. Хотя чувствительны в природе и практике надлежащего выполнения этой процедуры приведет к изоляции этих RNP комплексов, которые до недавнего времени были inaccessible для обнаружения и анализа.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> 1 М ДТТ </td><td> Рыбак </td><td> BP172-5 </td><td> DTT </td></tr><tr><td> ДНКазы 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> РНКазы бесплатно </td></tr><tr><td> Этилендиамин Tetraccetic кислота </td><td> Рыбак </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> Гликоген </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> Сигма </td><td> H3375-100G </td><td> рН 7,0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> Рыбак </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 М MgCl 2 </td><td> Рыбак </td><td> СиP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 буфера </td><td> * См. ниже </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Полисом буфера для лизиса </td><td> * См. ниже </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Протеаза таблетки ингибитора коктейль </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> Белки сефарозой бусины </td><td> Сигма </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Протеиназы K </td><td> Рыбак </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> РНКазы Out ингибитор РНКазы </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 ЕД / мкл </td></tr><tr><td> 1 М NaCl </td><td> Рыбак </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Сульфат натрия додецилсульфата </td><td> Рыбак </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 М Трис-HCl </td><td> Рыбак </td><td&gt; BP153-500 </td><td> рН 7,4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Ванадил комплексы рибонуклеозид </td><td> Новая Англия Labs </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> Реагент Workup </td></tr><tr><td> Подготовка реагентов в РНКазы / аз-бесплатно, DEPC обработанные изделия из стекла </td></tr><tr><td> Полисом буфера для лизиса </td></tr><tr><td> 100 мМ KCl </td></tr><tr><td> 5 мМ MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 мМ HEPES (рН 7,0) </td></tr><tr><td> 0,5% NP40 </td></tr><tr><td> 1 мМ DTT </td></tr><tr><td> 100 ед / мл РНКазы Out </td></tr><tr><td> 400 мкМ VRC </td></tr><tr><td> Ингибитор протеазы коктейль таблетки </td></tr><tr><td> 5 мл буфера для лизиса полисом </td></tr><tr><td> Добавить 50 мкл 1 М HEPES (рН 7,0) </td></tr><tr><td> 500 мкл 1 М KCL </td></tr><tr><td> 25 мкл 1 М MgCl 2 </td></tr><tr><td> 25 мкл NP40 </td></tr><tr><td> 4,7 мл РНКазы ДНКазой свободного H 2 O </td></tr><tr><td> 50 мкл 1 М ДТТ </td></tr><tr><td> 12,5 мкл из 100 ЕД / мл РНКазы Out </td></tr><tr><td> 200 мкл ингибитора протеазы коктейль (растворенного в зависимости от производителя) </td></tr><tr><td> 10 мкл 200 мМ VRC (во время использования) </td></tr><tr><td> NT2 буфера </td></tr><tr><td> 50 мМ Трис-HCl (рН 7,4) </td></tr><tr><td> 150 мМ NaCl </td></tr><tr><td> 1 мМ MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0,05% NP40 </td></tr><tr><td> 1 л NT2 буфера </td></tr><tr><td> 50 мл Трис (рН 7,4) </td></tr><tr><td> 30 мл 5 М NaCl </td></tr><tr><td> 1 мл 1 М MgCl <suB&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 мкл NP40 </td></tr><tr><td> 820 мл РНКазы ДНКазой свободного H 2 O </td></tr></tbody></table>

method for the isolation and identification of mrnas, micrornas and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using rip-chip

В результате развития высокой пропускной последовательности и эффективного анализа микрочипов, глобальный анализ экспрессии гена стала простой и доступной форме сбора данных. Во многих исследованиях и моделях болезни, однако, устойчивые уровни состояния целевой мРНК гена не всегда напрямую коррелирует с устойчивым уровнем белка государства. Пост-транскрипционной регуляции генов является вероятным объяснением расхождения между ними. Движимый связывание РНК белков (РСБ), пост-транскрипционной регуляции влияет локализации мРНК, стабильности и перевода путем формирования рибонуклеопротеидных (RNP) комплекс с целевой мРНК. Выявление этих неизвестных целей De Novo мРНК из клеточных экстрактов в комплексе RNP имеет решающее значение для понимания механизмов и функций RBP и вытекающих из них влияет на белковый выход. Этот протокол описывает метод называется RNP иммунопреципитации-микрочипов (RIP-Chip), который позволяет для идентификации сpecific мРНК, связанные в рибонуклеопротеидных комплекса, при изменении условий эксперимента, наряду с возможностью дальнейшей оптимизации эксперимента для отдельных исследователей. При этом важным экспериментальным инструментом, исследователи могут изучать сложные механизмы, связанные с пост-транскрипционной регуляции генов, а также других взаимодействий рибонуклеопротеидных.

Watch this Scientific Journal Video about Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip at JoV

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Шаг за шагом протокол выделения и идентификации РНК связаны комплексов через RIP-Chip.

Метод выделения и идентификации мРНК, микроРНК и белковых компонентов рибонуклеопротеидных комплексы из клеточных экстрактов использованием RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Подготовка и Фракционирование Xenopus laevis Яйцо Экстракты

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

Очистка и визуализация гриппа Вирусный комплексы рибонуклеопротеидных

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Идентификация белковых комплексов с количественной протеомики в CEREVISIAE С.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Выделение лабильной Multi-белковые комплексы по В естественных условиях Контролируемые Сотовая сшивания и иммуно-магнитного аффинной хроматографии

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Идентификация и характеристика гликозилирования белков с использованием конкретных эндо-и exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Определение белковых комплексов в<em&gt; Кишечной палочки</em&gt; С помощью последовательного аффинной очистки пептидов в сочетании с тандемной масс-спектрометрии

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Идентификация пост-трансляционных модификаций растительных белковых комплексов

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Выделение кровеносных сосудов, полученных мультипотентные прекурсоров от человека скелетных мышц

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

АСМ на основе карт из упругих свойств клеточных стенок: на ткани, клеточном, и субклеточных резолюций

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Процедура оценки эффективности флокулянтов для удаления дисперсных частиц из растительных экстрактов

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...