Name: use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung
Uploaded: 2012-06-05T12:00:00
Duration: 7 min 46 s
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Wir erkennen die Unterstützung des Vereinigten Königreichs National Institute for Health Research, die Dr Hadwen Trust for Humane Research, der führende britische medizinischen Forschung Nächstenliebe Finanzierung ausschließlich tierversuchsfreie Forschungsmethoden zu Tierversuchen ersetzen, und dem Wellcome Trust (Grant 089215). Wir erkennen auch Novartis Pharmaceuticals UK Ltd (unrestricted educational grant).

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	<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+(version+8).">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).</li><li>Worlitzsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).</li><li>Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

In dieser Studie verwendeten wir ein neues in vitro Modell basierend auf ASM zu replizieren P. aeruginosa Biofilm Bedingungen innerhalb der CF Lunge 4. Das Modell wurde erfolgreich für die kleinräumige, Hochdurchsatz-Screening von antimikrobiellen Wirkstoffen modifiziert. Die kritischen Schritte dieses Tests sind: <ol><li> Konsequente Vorbereitung der ASM Medien und Aufrechterhaltung der Sterilität. Wir haben viele Stunden, um die Optimierung des in der jede Komponente hinzugefügt, um reproduzierbare Ergebnisse jedes Mal gewidmet ist. Die Filtration des ASM ist langsam, ist aber vorzuziehen, Autoklavieren, die die Muzin-Komponente beschädigt werden kann. Wir raten den Zusatz von Antibiotika, wie von anderen vorgeschlagen 11, weil diese erheblichen Selektionsdruck, Antriebs-Mutationen auferlegen können, induzieren Prophagen Lyse 16 und signifikante Veränderung der Expression von mehreren bakteriellen Genen. </li><li> Der Test sollte nach dem Volumen o optimiert werdenf ASM verwendet. Shaking Geschwindigkeiten sind für kleinere Volumina erhöht und einen kürzeren Lebenszyklus Biofilm beobachtet wird. </li></ol> Eine naheliegende Anwendung der kleinräumigen ASM Biofilm-Modell ist die realistischere Bestimmung der Biofilm antimikrobiellen Empfindlichkeiten (BSMIC 90). Anaerobe und mikroaerophilen Nischen in der CF-Lunge und es gibt Belege dafür, dass Sauerstoff tief innerhalb reife Biofilme 2, 17 begrenzt. Hier zeigen wir, dass 10/14 klinischen P. aeruginosa-Isolaten von CF-Patienten weisen eine erhebliche Sputum (4 - ≥ 128-fach) Abnahme der Empfindlichkeit auf Tobramycin unter mikroaerophilen Bedingungen in ASM. Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass Antibiotika wie Tobramycin, möglicherweise weniger wirksam gegen P. aeruginosa-Infektionen in der Lunge CF als durch herkömmliche Methoden Empfindlichkeitsprüfung angegeben. Diese Ergebnisse spiegeln früheren Studien über die antimikrobielle Empfindlichkeit von Biofilmen 10. Klein-Maßstab ASM-Assays somit eine einfache Plattform mit hohem Durchsatz zur Erzeugung aussagekräftiger Antibiotikaempfindlichkeit Daten besser zu informieren therapeutische Entscheidungen. Der Test wird in der gleichen Weise wie herkömmliche Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung, daß einzelne Kolonien für das Screening, die nicht repräsentativ für die gesamte Bevölkerung können aufgenommen beschränkt. Wir glauben jedoch, dass ein Ansatz, (i) Verwendung von nicht-Oberfläche befestigt Biofilmwachstum und (ii) für mikroaerophilen Bedingungen, eine klare Alternative und eine mögliche Verbesserung bestehender Methoden darstellt. Wir schließen daraus, dass dieser Test ein geeignetes Modell, um zu studieren, ist P. aeruginosa Biofilm Populationen. Weitere Tests im klinischen Umfeld würde prüfen, ob Antibiotika-Empfindlichkeiten auf Biofilm-Basis gewachsen P. aeruginosa könnte auf unterschiedliche Antibiotika-Entscheidungen mit möglicherweise verbessert mikrobiologischen und klinischen Ergebnissen führen. Ähnliche Untersuchungen mit klassischen Biofilm-Modelle haben gezeigt, dass BSMIC Werten führenverschiedene Empfehlungen zur antibiotischen Behandlung 5,17. Zusätzlich zur Prüfung der Wirksamkeit von Antiinfektiva, stellt der ASM-System eine billige, einfache und reproduzierbare Alternative zu Tiermodellen für Studien wie die im Verständnis der Diversifizierung der P. richtet aeruginosa Bevölkerungen. Wir haben umfangreiche Heterogenität in natürlichen Populationen von P. beobachtet aeruginosa aus CF-Patienten Sputum 18, 19 erholt. Ähnliche phänotypische und genotypische Diversifizierung kann während des Wachstums in ASM-4 (und unsere unveröffentlichte Daten) beobachtet werden, so dass es ein attraktives In-vitro-Modell der CF Lungenerkrankungen. Die relative Einfachheit des ASM-Modell macht es einfach zu entwerfen langfristige Anpassung Experimente sollen, zum Beispiel bei der Überwachung der Auswirkungen von Antibiotika oder anderen Belastungen auf P. aeruginosa Bevölkerung Divergenz. Darüber hinaus können andere bakterielle Erreger in angebaut werdenASM. Zum Beispiel, Fouhy et al. ASM 2007 verwendet haben, um die Biofilmbildung von S. studieren maltophillia 20.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> DNA aus Fischsperma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74782 </td></tr><tr><td> Mucin aus Schweine-Magen-, Typ-II- </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2378 </td></tr><tr><td> L-Alanin </td><td> Acros Organics </td><td> 102830250 </td></tr><tr><td> L-Arginin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5006 </td></tr><tr><td> L (+)-Asparagin-Monohydrat </td><td> Acros Organics </td><td> 175271000 </td></tr><tr><td> L (+)-Asparaginsäure </td><td> Acros Organics </td><td> 105041000 </td></tr><tr><td> L-Cystein </td><td> Sigma-Adrich </td><td> 168149 </td></tr&gt; <tr><td> L (+)-Glutaminsäure </td><td> Acros Organics </td><td> 156211000 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Acros Organics </td><td> 220911000 </td></tr><tr><td> L-Histidin </td><td> Sigma-Adrich </td><td> H8000 </td></tr><tr><td> L-Isoleucin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2752 </td></tr><tr><td> L-Leucin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L8000 </td></tr><tr><td> L (+)-Lysin-Monohydrochlorid </td><td> Acros Organics </td><td> 125222500 </td></tr><tr><td> L-Methionin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9625 </td></tr><tr><td> L-Phenylalanin </td><td> Acros Organics </td><td> 130310250 </td></tr><tr><td> L-Prolin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380 </td></tr><tr><td> L-Serin </td><td> Acros Organics </td><td> 132660250 </td></tr><tr><td> L-Threonin </td><td> Acros Organics </td><td> 138930250 </td></tr><tr><td> L (-)-Tryptophan </td><td> Acros Organics </td><td> 140590250 </td></tr><tr><td> L-Tyrosin </td><td> Acros Organics </td><td> 140641000 </td></tr><tr><td> L-Valin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V0500 </td></tr><tr><td> Diethylentriaminpentaessigsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 32318 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S/3160/60 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> BDH </td><td> BDH0258 </td></tr><tr><td&gt; KOH </td><td> BDH </td><td> BDH0262 </td></tr><tr><td> Eigelb-Emulsion </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 17148 </td></tr><tr><td> ME 2 Membran-Vakuumpumpe </td><td> Vacuubrand </td><td> 696126 </td></tr><tr><td> Steritop Filter (Porengröße: 0,22 um, Hals-Größe: 45 mm) </td><td> Millipore </td><td> SCGPT10RE </td></tr><tr><td> Luria-Bertani-Medium </td><td> Sigma </td><td> L2897 </td></tr><tr><td> 96-Well-Mikrotiterplatten </td><td> Sarstedt </td><td> 82,1581 </td></tr><tr><td> 24-Well-Gewebekultur-behandelten Platten </td><td> Iwaki </td><td> 3820-024 </td></tr><tr><td> CampyGen Gaserzeugung Packs </td><td> Oxoid </td><td> CN0025 </td></tr><tr><td> Microaerophilic Kammer </td><td> Oxoid </td><td> HP0011 </td></tr><tr><td> Tobramycin Sulfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1783 </td></tr><tr><td> Cellulase von Aspergillus niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 22178 </td></tr><tr><td> Resazurin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 199303 </td></tr><tr><td> Citrate.H 2 0 </td><td> BDH </td><td> BDH0288 </td></tr><tr><td> Fluostar Omega Mikroplatten-Reader </td><td> BMG-Labtech </td><td> SPECTROstar Omega </td></tr></tbody></table>

use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung

Es wächst die Besorgnis über die Relevanz der in vitro antimikrobielle Empfindlichkeitstests wann Isolate von P. angewendet aeruginosa von zystischer Fibrose (CF)-Patienten. Bestehende Methoden beruhen auf einzelne oder wenige Isolate wachsen aerob und planktonically. Vorgegebenen cut-offs werden verwendet, um festzulegen, ob die Bakterien empfindlich oder resistent gegenüber einem bestimmten Antibiotikum 1 sind. Doch während chronische Lungeninfektionen bei CF, P. aeruginosa in Biofilmen Populationen existieren und es gibt Hinweise, dass die Umwelt weitgehend mikroaerophile 2 ist. Der extreme Unterschied zwischen den Bedingungen in Bakterien in der Lunge und denen während der diagnostischen Tests haben Zweifel an der Zuverlässigkeit und sogar Relevanz dieser Tests 3 genannt. Künstliche Sputum Medium (ASM) ein Kulturmedium, das die Komponenten des CF-Patienten Sputum, einschließlich Aminosäuren, Mucin und freie DNA. S. aeruginosa &lt;/ Em&gt; Wachstum im ASM Mimik Wachstum während der CF-Infektionen, mit der Bildung von Selbst-Aggregation Biofilmstruktur und Bevölkerung Divergenz 4,5,6. Das Ziel dieser Studie war es, eine Mikrotiterplatte Assay gegen antimikrobielle Empfindlichkeit von P. studieren entwickeln aeruginosa auf das Wachstum in ASM, die für beide mikroaerophile und aeroben Bedingungen beruht. Ein ASM-Assay wurde in einem Mikrotiterplatten-Format entwickelt. P. aeruginosa Biofilme wurden für 3 Tage vor der Inkubation mit antimikrobieller Mittel zu entwickeln in verschiedenen Konzentrationen für 24 Stunden. Nach Biofilm Störung, die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Färbung mit Resazurin gemessen. Dieser Assay wurde verwendet, um die sessile Zelle minimale Hemmkonzentration (SMIC) von Tobramycin für 15 verschiedene P. ermitteln aeruginosa-Isolaten unter aeroben und mikroaerophilen Bedingungen und SMIC-Werte wurden mit denen mit Standard-Brühe Wachstum verglichen. Zwar gab eseinige Hinweise für eine erhöhte MHK-Werte für Isolate in ASM gewachsen, wenn ihre planktonischen Gegenstücken verglichen wurden die grössten Unterschiede zu Bakterien in mikroaerophilen Bedingungen, die eine wesentlich erhöhte Resistenz zeigte, bis zu einer&gt; 128 fache gegenüber Tobramycin in der ASM-System getestet gefunden, wenn gegenüber Assays unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Der fehlende Zusammenhang zwischen Anfälligkeit aktuellen Prüfmethoden und dem klinischen Ergebnis der Gültigkeit der aktuellen Methoden 3 in Frage gestellt. Mehrere in vitro-Modelle wurden bereits auf S. Studie verwendet aeruginosa Biofilm 7, 8. Allerdings beruhen diese Methoden auf Oberfläche befestigt Biofilmen, während die ASM-Biofilme, die auf der CF-Lunge 9 beobachtet ähneln. Darüber hinaus hat verringert Sauerstoffkonzentration im Schleim wurde gezeigt, dass das Verhalten von P. verändern aeruginosa 2 und beeinflussen Antibiotikaempfindlichkeit 10. Deshalb using ASM unter mikroaerophilen Bedingungen können vorsehen, eine realistischere Umgebung, in der Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Mitteln zu studieren.

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Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Aktuelle Diagnostik antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung beruht auf der Plankton-Wachstum von Isolaten in nährstoffreichen, aeroben Bedingungen. Hier beschäftigen wir eine Alternative künstliche Sputum mittel-bis Antimikrobielle Empfindlichkeit von Pseudomonas aeruginosa Biofilmen unter aeroben und mikroaerophilen Bedingungen mehr repräsentativ für die Mukoviszidose-Lunge zu untersuchen.

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Research

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Immunology and Infection

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RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

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RNA Isolierung von Pseudomonas aeruginosa Kolonisierung der Murine Gastrointestinaltrakt

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Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

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A Robust Pneumonia Modell in intaktem Immunsystem Nagetiere zur Bewertung antibakterieller Wirksamkeit gegen<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; oder<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

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