Name: use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung
Uploaded: 2012-06-05T12:00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung at JoVE.com

Vi erkjenner støtte fra Storbritannia National Institute for Health Research, Dr Hadwen Trust for Humane forskning, Storbritannias ledende medisinsk forskning veldedighet finansiering utelukkende ikke-animalske forskning teknikker for å erstatte dyreforsøk, og Wellcome Trust (Grant 089 215). Vi erkjenner også Novartis Storbritannia Ltd (ubegrenset lærerikt tilskudd).

1. Utarbeidelse av Kunstig Oppspytt Medium (ASM) <ol><li> Tilsett 4 g DNA fra fisk sperm til 250 ml sterilt vann svært langsomt over en periode på flere timer. DNA tar flere timer å oppløses fullstendig, og kan bli rørt over natten i romtemperatur. </li><li> Tilsett 5 g mucin fra svin mage (type II) sakte til 250 ml sterilt vann til mucin er oppløst helt. Løsningen kan bli rørt over natten ved 4 ° C. </li><li> Løs opp 0,25 g av hver essensielle og ikke-essensielle L-aminosyre, med unntak av L-tyrosin og L-cystein, i 100 ml sterilt vann. Løs opp 0,25 g L-cystein i 25 ml 0,5 M kaliumhydroksid (M r 56,11 g / mol) og 0,25 g av L-tyrosin i 25 ml sterilt vann. </li><li> Løs 5,9 mg diethylenetriaminepentaacetic syre (DTPA), 5 g NaCl og 2,2 g KCl i 100 ml sterilt vann. </li><li> Kombiner DNA, mucin, L-aminosyrer, DTPA, NaCl og KCl i en 1 liters flaske. </li><li> Tilsett 5 ml av eggeplomme emulsion og fyll til ca 850 ml med sterilt vann. </li><li> Juster pH til 6,9 med 1 M Tris (pH 8,5; M r 121,14) og bringe volumet til 1 liter med sterilt vann. </li><li> Steriliser ASM ved filtrering med en Vacuubrand ME 2 pessar vakuumpumpe og Millipore Steritop filterenheter med en pore og hals størrelse på 0,22 mikrometer og 45 mm, henholdsvis. Hver Steritop filter enhet kan gjenbrukes umiddelbart opp til tre ganger, men filtrene må skylles to ganger med sterilt vann før gjenbruk. Den filtrering prosessen er langsom og kan utføres over 2 dager. Andre versjoner av ASM har blitt utviklet som bruker tillegg av antibiotika i stedet for filtrering 11 men på grunn av mulige interaksjoner, anbefaler vi ikke metoden for denne applikasjonen. </li><li> Ufiltrert og filtrert ASM bør lagres ved 4 ° C i mørket. Bruk fersk ASM anbefales imidlertid kan den holdes under disse forholdene for maksimum en måned. </li&gt; </ol> 2. Fastsettelse av planktoniske fastsittende Cell Minimum Metabolsk hemmende konsentrasjon (PSMIC) <ol><li> For å bestemme minimum metabolsk hemmende konsentrasjon (PSMIC) verdier for 15 planktonically vokst P. aeruginosa isolater, den microdilution metoden bør utføres, som beskrevet i retningslinjene fra British Society for Antimicrobial Kjemoterapi BSAC 12. Antibiotika av valget, i dette tilfellet tobramycin sulfat, er serielt fortynnes i Luria-Bertani (LB) medium i en 96-brønns microtitre plate for å gi en passende utvalg av antibiotika konsentrasjoner. </li><li> Fortynn overnattingsturer kulturer av P. aeruginosa i LB til en OD 600 på 0,05 (± 0,01) og tilsett 100 mL volumer til brønnene i 96-brønnen microtitre plate som inneholder 100 mL av serielt fortynnet antibiotikum. I dette tilfellet varierte de endelige konsentrasjonene av tobramycin sulfat mellom 512 til 0,5 mikrogram / ml. Åtte gjentak av hver antibiotic konsentrasjon bør utføres. </li><li> Negative kontroll brønner for hver isolere bør settes opp, hvor ingen antibiotika er lagt til. I tillegg bør åtte brønner inneholde bare LB for bruk som en blank under nedstrøms analyse (§ 2.6). </li><li> Inkuber 96-brønnen mikrotiterplater for 1 - 2 dager ved 37 ° C uten risting under aerobe eller mikroaerofile (5% O 2, 10% CO 2, og 85% N 2) forhold. Mikroaerofile vilkår er innhentet ved hjelp CampyGen gass generasjons pakker i store anaerobe krukker. </li><li> Etter inkubasjon, er bakteriell vekst bestemmes ved å måle absorbansen av bakteriekultur i hver brønn ved en bølgelengde på 600 nm ved hjelp av en Fluostar Omega mikroplateleser og MARS Dataanalyse Software. </li><li> Absorpsjon fra antibiotika-behandlede planktoniske kulturer (A antibiotika behandlet planktoniske celler) og opptak fra de negative kontrollene (en negativ kontroll) bør korrigeres ved subtrahereion av bakgrunnen absorbans hentet fra brønnene inneholder LB bare (A blank). Andelen hemming av levedyktighet er senere beregnet som (bety en antibiotika behandlet planktoniske celler / bety en negativ kontroll) x 100%. Den PSMIC 90 er definert som antibiotika konsentrasjonen forårsaker 90% hemming av planktoniske bakterievekst. </li><li> For å bestemme bakteriell levedyktighet etter behandling med antibiotika av valget, 10 mL av 0,02% (v / v) resazurin (fortynnet i destillert vann) blir lagt til hver brønn og platene blir inkubert under aerobe forhold i 1 - 2 timer ved 37 ° C, mens rist ved 150 rpm. Levedyktige celler vil redusere den blå resazurin fargestoff til rosa fluorescerende resorufin form. </li><li> Etter inkubasjon med resazurin, overvåke fluorescens av hver brønn med en eksitasjon bølgelengde på 540 nm og en emisjon bølgelengde på 590 nm i en Fluostar Omega mikroplateleser. Dataene skal analyseres som beskrevet værelav. </li></ol> 3. Bestemmelse av Biofilm fastsittende Cell Minste hemmende konsentrasjon (BSMIC) <ol><li> Overnattingsturer kulturer av P. aeruginosa (i dette tilfellet, er 15 isolater av P. aeruginosa brukt) bør fortynnes i LB til en OD 600 på 0,05 (± 0,01), og deretter ytterligere fortynnet 1:100 i frisk ASM (totalt volum 1,8 ml). </li><li> De fortynnede kulturene (1,8 ml) bør legges til hver brønn av en 24-brønns vevskultur behandlet plate. Tre brønner bør inneholde ASM bare for bruk som en blank under nedstrøms analyse (§ 3.9). </li><li> Sikre 24-brønns plater med laboratorium Parafilm og inkuber i 3 dager under aerobe eller mikroaerofile forholdene ved 37 ° C, mens rist ved 75 rpm. Mikroaerofile tilstander bør innhentes ved hjelp CampyGen gass generasjons pakker i store anaerobe krukker. </li><li> Fortynn antibiotika av valget, i dette tilfellet tobramycin sulfat, for å gi en passende konsentrasjonsområde i friskASM. I dette tilfellet varierte endelige konsentrasjoner mellom 512-1 mikrogram / ml. Legg hver konsentrasjon av antibiotika, i volum på 200 mL, til de aktuelle brønnene på 24-brønns plater. Fire gjentak av hver antibiotika konsentrasjon bør utføres. Biofilm ikke eksponert mot antibiotika av valget ble brukt som en negativ kontroll. </li><li> Sikre 24-brønns plater med laboratorium Parafilm og inkuberes under aerobe eller mikroaerofile vilkårene for ytterligere 24 timer ved 37 ° C, mens rist ved 75 rpm. </li><li> Etter inkubering i nærvær av antibiotika av valget, forstyrre den bakterielle biofilmer med 100 mL av 100 mg / ml Cellulase (utvannet i 0,05 M citratbuffer [9,6 g / l Citrate.H 2 0 i vann og pH til 4,6 med NaOH] ) og Inkuber 24-brønns plater under aerobe forhold ved 37 ° C, mens rist ved 150 rpm i 1 time. Ved behov, kan biofilm bli ytterligere forstyrret av manuell pipettering på dette stadiet. </li><li> For å bestemme metabolske aktiviteterav bakterieceller frigjøres fra forstyrret biofilm, 100 mL av 0,02% (v / v) resazurin (fortynnet i destillert vann) bør legges til hver brønn av de 24 brønner plater og inkuberes i 1 - 2 t ved 37 ° C , mens rist ved 150 rpm. </li><li> Etter inkubasjon med resazurin, måle fluorescens av hver brønn med en eksitasjon bølgelengde på 540 nm og en emisjon bølgelengde på 590 nm i en Fluostar Omega mikroplateleser og MARS Dataanalyse Software. </li><li> Fluorescens fra antibiotika-behandlet biofilm (F antibiotika-behandlede biofilm) og fluorescens fra de negative kontrollene (F negativ kontroll) bør korrigeres ved subtraksjon av bakgrunnsfluorescens innhentet fra brønnene inneholder ASM bare (F blank). Andelen hemming av levedyktighet er senere beregnet som (gjennomsnittlig F antibiotika behandlet biofilm / bety F negativ kontroll) x 100%. Den BSMIC 90 er definert som antibiotic konsentrasjon forårsaker 90% hemming av metabolsk aktivitet. </li></ol> 4. Representative Resultater ASM biofilmdannelse er mulig i små (2 ml) volumer og biofilm er fullt dannet innen 3 dager (Figur 1a). Dette kan påvises ved strengt pipettering biofilm, som bør være vanskelig å forstyrre. De microcolonies er sammenlignbare med de som var dyrket i større volum 4 (figur 1B). Figur 2 viser store forskjeller mellom celler dyrket planktonically og i en biofilm som oppdages ved elektronmikroskopi mikroskopisk bildeanalyse. Biofilm kulturer viser tydelig er betydelige nivåer av ekstracellulær matrix som omgir cellene og individuelle strukturer innen biofilm vanskelig å identifisere. Flere studier tyder på at biofilm livsstil kan påvirke antimikrobiell følsomhet 13, 14. Vårt småskala ASM analyse kan brukes til å Determine den BSMIC av flere antibiotika for flere isolater samtidig. Arbeidsflyten av analysen er vist i figur 3. Effekten av antibiotika på bakteriell celleviabilitet kan måles ved hjelp av resazurin analysen. Antibiotika, i dette tilfellet tobramycin, kan legges til den etablerte biofilm og ruges i 24 timer. Etter dette biofilm blir forstyrret og resazurin legges. Metabolsk aktive celler kan redusere resazurin fargestoff som resulterer i en fargeendring fra blått (resazurin) til rosa (resorufin) 15. Figur 4A viser et eksempel analyse der P. aeruginosa ble inkubert med ulike konsentrasjoner av tobramycin før biofilm avbrudd og tillegg av resazurin i en microtitre plate. Den blå ikke-fluoriserende farge indikerer ikke-levedyktige celler, mens levedyktige celler redusere fargestoff til rosa fluorescerende form, resorufin. Den SMIC kan da beregnes ved å konvertere fluorescens i prosentgjenværende bakteriell levedyktighet. Figur 4B viser endring i% levedyktighet med økende tobramycin konsentrasjon. 10% levedyktighet ble valgt som en cut-off for å beregne SMIC 90. Under aerobe forhold, tobramycin SMIC 90 verdiene er høyere for celler dyrket som en biofilm enn planktoniske kulturer. Tabell 1 viser variasjonen i PSMIC 90 og BSMIC 90 for alle isolater testet. Tabell 2 viser at under aerobe forhold, ble det en dramatisk økning i resistens mot tobramycin (2 til&gt; 32 ganger økning i SMIC) observert for de fleste isolater når vokst i ASM (biofilm mode) sammenliknet med LB (planktoniske modus). I tillegg viste biofilmer dyrket under mikroaerofile forhold en økt SMIC på mellom 2 og&gt; 128 ganger i forhold til biofilm dyrket under aerobe forhold. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig1.jpg" /> Figur1. Biofilm dannelsen av P. aeruginosa i ASM P. aeruginosa belastning PAO1 danner makroskopisk synlige klumper (microcolonies) når dyrket i ASM. A, Biofilmdannelse i 30 ml ASM kulturer (stor-skala) etter 7 dager vekst i skrukork glass Duran kolber. B, Biofilmdannelse i 2 ml ASM kulturer ( småskala) etter tre dagers vekst i 24-brønnen polystyren plater. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig2.jpg" /> Figur 2. TEM mikrografer av ASM biofilmer A / C TEM mikroskopbilder (x, 27 000) av PAO1 vokst planktonically og i ASM, henholdsvis B / D TEM micrograph (x57, 000) av PAO1grown planktoniske og i ASM, henholdsvis. Planktonically dyrket bakterier ble dyrket over natten i LB buljong. Biofilm ble dyrket i 7 dager i 30 ml ASM kulturer. Svart pilene referere til celler i biofilm og stjernene viser til ekstracellulære rom. Skala barer = 1mikrometer. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig3.jpg" /> Figur 3. Arbeidsflyt av ASM biofilm antimikrobiell følsomhet analysen. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig4.jpg" /> Figur 4. Bruk av resazurin for bestemmelse av antibiotika følsomhet Bakterielle celler ble inkubert med ulike konsentrasjoner av antibiotika og de ​​resterende metabolsk aktivitet ble fastsatt ved hjelp resazurin. A, indikerer Den blå ikke-fluorescerende oksidert form av resazurin ikke-levedyktige celler og er redusert med metabolsk aktive celler til rosa fluoriserende resorufin. B, er fluorescensintensiteten konvertert til prosentandel av resterende bakteriell levedyktighet. 10% levedyktighet ble valgt som cut-off for å beregne MSMIC90. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3857/3857fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å vise Lar</a>ger figur. </span&gt; <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> Stammer </td><td colspan="2"> PSMIC 90 (mikrogram / ​​ml) 1 </td><td colspan="2"> BSMIC 90 (mikrogram / ​​ml) 1 </td></tr><tr><td> Aerobic </td><td> Mikroaerofile 2 </td><td> Aerobic </td><td> Mikroaerofile 2 </td></tr><tr><td> PAO1 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 8 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td colspan="5"> Liverpool Epidemic Strain (LES) isolerer </td></tr><tr><td> LESB58 21 </td><td> 8 </td><td> 64 </td><td> 64 </td><td> 128 </td></tr><tr><td> LES400 22 </td><td> 32 </td><td> 128 </td><td> 8 </td><td> 256 </td></tr><tr><td> LESB25 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 256 </td><td> 512 </td></tr><tr><td> LESB55 </td><td> 16 </td><td> 64 </td><td> 64 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> LESB64 </td><td> 16 </td><td> 64 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> LES431 22 </td><td> 4 </td><td> 8 </td><td> 32 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> LESB49 </td><td> 16 </td><td> 64 </td><td> 64 </td><td> 256 </td></tr><tr><td> LES109 </td><td> 32 </td><td> 128 </td><td> 32 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td colspan="5"> Ikke-LES isolater </td></tr><tr><td> 49461 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 16 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 59032 </td><td> 0.5 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 59073 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 59076 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 32 </td><td> &gt; 512 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> 27 </td><td> 8 </td><td> 16 </td><td> 4 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 45 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 4 </td><td> &gt; 512 </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Følsomhet av P. aeruginosa til tobramycin. 1 For bestemmelse av PSMICs og BSMICs tobramycin ble brukt i to-fold seriefortynning alt 512 til 0,5 mikrogram / ml (n = 8 for hver konsentrasjon) og 512-1 mikrogram / ml (n = 4 for hver konsentrasjon), henholdsvis;; PSMICs ble bestemt ved hjelp av standard microdilution metode 1. 2 mikroaerofile forholdene var 5% O 2, 10% CO 2, og 85% N 2. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> Sil </td><td colspan="4"> PSMIC 90 / BSMIC 90 ganger endring 1 </td></tr><tr><td> PSMIC aerobic → PSMIC mikroaerofile </td><td> BSMIC aerobic → BSMIC mikroaerofile </td><td> PSMIC aerobic → BSMIC aerobic </td><td> PSMIC mikroaerofile → BSMIC mikroaerofile </td></tr><tr><td> PAO1 </td><td> 0 </td><td> &gt; 64 </td><td> 2 </td><td> 128 </td></tr><tr><td colspan="5"> LES isolerer </td></tr><tr><td> LESB58 </td><td> 8 </td><td> 2 </td><td> 8 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> LES400 </td><td> 4 </td><td> 32 </td><td> 0,25 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> LESB25 </td><td> 2 </td><td> 2 </td><td> 16 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> LESB55 </td><td> 4 </td><td> &gt; 8 </td&gt; <td> 4 </td><td> &gt; 8 </td></tr><tr><td> LESB64 </td><td> 4 </td><td> ND </td><td> &gt; 32 </td><td> &gt; 8 </td></tr><tr><td> LES431 </td><td> 2 </td><td> &gt; 16 </td><td> 8 </td><td> &gt; 64 </td></tr><tr><td> LESB49 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> LES109 </td><td> 4 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> &gt; 4 </td></tr><tr><td colspan="5"> Ikke-LES isolater </td></tr><tr><td> 49461 </td><td> 2 </td><td> &gt; 32 </td><td> 0 </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> 59032 </td><td> 4 </td><td> &gt; 128 </td><td> 8 </td><td> &gt; 256 </td></tr><tr><td> 59073 </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td></tr><tr><td> 59076 </td><td> 2 </td><td> &gt; 16 </td&gt; <td> 2 </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 2 </td><td> &gt; 128 </td><td> 0.5 </td><td> &gt; 32 </td></tr><tr><td> 45 </td><td> 2 </td><td> &gt; 128 </td><td> 0,25 </td><td> &gt; 16 </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Fold endring av PSMICs og BSMICs til tobramycin. 1 ND, ikke bestemt; verdier i fet skrift indikerer SMIC fold endringer&gt; 10.

<ol>
	<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+(version+8).">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).</li><li>Worlitzsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).</li><li>Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+testing+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+and+clinical+response+to+parenteral+antibiotic+administration:+lack+of+association+in+cystic+fibrosis.">Susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates and clinical response to parenteral antibiotic administration: lack of association in cystic fibrosis.</a> Chest. 123, 1495-1502 (2003).</li><li>Sriramulu, D. D., Lunsdorf, H., Lam, J. S., Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcolony+formation:+a+novel+biofilm+model+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+the+cystic+fibrosis+lung.">Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung.</a> J. Med. Microbiol. 54, 667-676 (2005).</li><li>Garbe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+JG024,+a+pseudomonas+aeruginosa+PB1-like+broad+host+range+phage+under+simulated+infection+conditions.">Characterization of JG024, a pseudomonas aeruginosa PB1-like broad host range phage under simulated infection conditions.</a> BMC Microbiol. 10, 301 (2010).</li><li>Naughton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+AES-1+exhibits+increased+virulence+gene+expression+during+chronic+infection+of+cystic+fibrosis+lung.">Pseudomonas aeruginosa AES-1 exhibits increased virulence gene expression during chronic infection of cystic fibrosis lung.</a> PLoS One. 6, e24526 (2011).</li><li>Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J. C., Gibson, R. L., Burns, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pseudomonas+biofilm+susceptibilities+to+assign+simulated+antibiotic+regimens+for+cystic+fibrosis+airway+infection.">Use of Pseudomonas biofilm susceptibilities to assign simulated antibiotic regimens for cystic fibrosis airway infection.</a> J. Antimicrob. Chemother. 56, 879-886 (2005).</li><li>Field, T. R., White, A., Elborn, J. S., Tunney, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oxygen+limitation+on+the+in+vitro+antimicrobial+susceptibility+of+clinical+isolates+of+Pseudomonas+aeruginosa+grown+planktonically+and+as+biofilms.">Effect of oxygen limitation on the in vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa grown planktonically and as biofilms.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 24, 677-687 (2005).</li><li>Bjarnsholt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+in+the+respiratory+tract+of+cystic+fibrosis+patients.">Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients.</a> Pediatr. Pulmonol. 44, 547-558 (2009).</li><li>Hill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+susceptibilities+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+derived+from+patients+with+cystic+fibrosis+under+aerobic,+anaerobic,+and+biofilm+conditions.">Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).</li><li>Fung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+mucin-containing+synthetic+growth+medium+mimicking+cystic+fibrosis+lung+sputum.">Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum.</a> J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).</li><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+(version+8).">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).</li><li>Rybtke, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+implication+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+in+infections.">The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections.</a> Inflamm Allergy Drug Targets. 10, 141-157 (2011).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway.">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 21, 595-599 (2008).</li><li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rapid+and+simple+non-radioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes:+an+alternative+to+[3H]thymidine+incorporation+assay.">A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> J. Immunol. Methods. 170, 211-224 (1994).</li><li>Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+antibiotic+treatment+on+bacteriophage+production+by+a+cystic+fibrosis+epidemic+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Effect of antibiotic treatment on bacteriophage production by a cystic fibrosis epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 55, 426-428 (2011).</li><li>Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum-sensing+signals+indicate+that+cystic+fibrosis+lungs+are+infected+with+bacterial+biofilms.">Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms.</a> Nature. 407, 762-764 (2000).</li><li>Mowat, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+Aeruginosa+Population+Diversity+and+Turnover+in+Cystic+Fibrosis+Chronic+Infections.">Pseudomonas Aeruginosa Population Diversity and Turnover in Cystic Fibrosis Chronic Infections.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. Med. , (2011).</li><li>Fothergill, J. L., Mowat, E., Ledson, M. J., Walshaw, M. J., Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+phenotypes+and+genotypes+within+populations+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+cystic+fibrosis+lung+during+pulmonary+exacerbations.">Fluctuations in phenotypes and genotypes within populations of Pseudomonas aeruginosa in the cystic fibrosis lung during pulmonary exacerbations.</a> J. Med. Microbiol. 59, 472-481 (2010).</li><li>Fouhy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusible+signal+factor-dependent+cell-cell+signaling+and+virulence+in+the+nosocomial+pathogen+Stenotrophomonas+maltophilia.">Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia.</a> J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).</li><li>Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+introduced+genomic+prophage+islands+are+critical+determinants+of+in+vivo+competitiveness+in+the+Liverpool+Epidemic+Strain+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Genome Res. 19, 12-23 (2009).</li><li>Carter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subtype+of+a+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+epidemic+strain+exhibits+enhanced+virulence+in+a+murine+model+of+acute+respiratory+infection.">A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection.</a> J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

I denne studien brukte vi en roman in vitro modell basert på ASM å replikere P. aeruginosa biofilm forhold innen CF lunge 4. Modellen ble endret vellykket for småskala, high-throughput testing av antimikrobielle midler. De kritiske trinnene i denne analysen er: <ol><li> Konsekvent utarbeidelse av ASM media og opprettholde sterilitet. Vi har viet lange timer for å optimalisere måten hver komponent er lagt for å oppnå reproduserbare resultater hver gang. Filtrering av ASM er treg, men er å foretrekke å autoklavering, som kan skade mucin komponenten. Vi vil ikke råde tillegg av antibiotika, som foreslått av andre 11 fordi dette kan ilegge betydelige selektive press, drive mutasjoner, indusere prophage lysis 16 og signifikant påvirker uttrykket av flere bakterielle gener. </li><li> Den analysen bør være optimalisert i henhold til volum of ASM brukt. Shaking hastigheter er økt for mindre volumer og en kortere biofilm livssyklus er observert. </li></ol> En åpenbar anvendelse av småskala ASM biofilm modellen er mer realistisk bestemmelse av biofilm antimikrobielle følsomhet (BSMIC 90). Anaerobe og mikroaerofile nisjer er tilstede i CF lunge og det er bevis for at oksygen er begrenset dypt inne moden to biofilm, 17. Her demonstrerer vi at 10/14 kliniske P. aeruginosa isolater fra CF pasient slim viser en betydelig (4 - ≥ 128 ganger) reduksjon i følsomheten for tobramycin etter mikroaerofile forhold i ASM. Resultatene av denne studien tyder på at antibiotika, for eksempel tobramycin, kan være mindre effektiv mot P. aeruginosa infeksjoner i CF lungene enn indikert ved konvensjonelle resistenstesting metoder. Disse resultatene gjenspeiler tidligere studier om den antimikrobielle mottakelighet av biofilm 10. Small-skala ASM analyser således gi en enkel høy gjennomstrømning plattform for å generere meningsfulle antibiotika mottakelighet data for å bedre informere terapeutiske beslutninger. Analysen er begrenset på samme måte som vanlig antibiotika resistenstesting i at enkle kolonier plukkes for screening som kanskje ikke er representative for hele befolkningen. Vi mener imidlertid at en tilnærming (i) bruk av ikke-overflate festet biofilm vekst og (ii) gjelder mikroaerofile forhold, representerer et klart alternativ og en potensiell forbedring til eksisterende metoder. Vi konkluderer at denne analysen er en hensiktsmessig modell for å studere P. aeruginosa biofilm populasjoner. Ytterligere testing i kliniske settinger ville avklare om antibiotika følsomhet basert på biofilm-vokst P. aeruginosa kan føre til ulike antibiotika valg med potensielt bedre mikrobiologiske og klinisk utfall. Lignende undersøkelser ved hjelp av klassisk biofilm modeller har vist at BSMIC verdier føretil ulike anbefalinger for antibiotikabehandling 5,17. I tillegg til testing for effektiviteten av anti-smittestoffer, representerer ASM systemet en billig, enkel og reproduserbar alternativ til dyremodeller for studier slik som de tar sikte på å forstå spredning av P. aeruginosa populasjoner. Vi har observert omfattende heterogenitet i naturlige populasjoner av P. aeruginosa utvinnes fra CF pasient 18 slim, 19. Lignende fenotypiske og genotypiske diversifisering kan observeres under vekst i ASM 4 (og våre upubliserte data), noe som gjør det til et attraktivt in vitro modell av CF lungelidelser. Den relative enkelhet av ASM-modellen gjør det enkelt å utforme langsiktige tilpasning eksperimenter rettet, for eksempel ved å overvåke effekten av antibiotika eller andre påkjenninger på P. aeruginosa befolkning divergens. I tillegg kan andre bakterielle patogener dyrkes iASM. For eksempel, Fouhy et al. 2007 har brukt ASM å studere biofilmdannelse ved S. maltophillia 20.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DNA fra fisk sperm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74782 </td></tr><tr><td> Mucin fra svin magen, type II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2378 </td></tr><tr><td> L-Alanine </td><td> ACROS Organics </td><td> 102830250 </td></tr><tr><td> L-Arginin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5006 </td></tr><tr><td> L (+)-asparagin monohydrat </td><td> ACROS Organics </td><td> 175271000 </td></tr><tr><td> L (+)-asparaginsyre </td><td> ACROS Organics </td><td> 105041000 </td></tr><tr><td> L-Cysteine </td><td> Sigma-Adrich </td><td> 168149 </td></tr&gt; <tr><td> L (+)-glutaminsyre </td><td> ACROS Organics </td><td> 156211000 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> ACROS Organics </td><td> 220911000 </td></tr><tr><td> L-Histidine </td><td> Sigma-Adrich </td><td> H8000 </td></tr><tr><td> L-Isoleucine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2752 </td></tr><tr><td> L-Leucine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L8000 </td></tr><tr><td> L (+)-Lysine monohydrochloride </td><td> ACROS Organics </td><td> 125222500 </td></tr><tr><td> L-metionin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9625 </td></tr><tr><td> L-fenylalanin </td><td> ACROS Organics </td><td> 130310250 </td></tr><tr><td> L-Proline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380 </td></tr><tr><td> L-Serine </td><td> ACROS Organics </td><td> 132660250 </td></tr><tr><td> L-Treonin </td><td> ACROS Organics </td><td> 138930250 </td></tr><tr><td> L (-)-Tryptofan </td><td> ACROS Organics </td><td> 140590250 </td></tr><tr><td> L-Tyrosin </td><td> ACROS Organics </td><td> 140641000 </td></tr><tr><td> L-Valin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V0500 </td></tr><tr><td> Diethylenetriaminepentaacetic syre </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 32318 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S/3160/60 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> BDH </td><td> BDH0258 </td></tr><tr><td&gt; KOH </td><td> BDH </td><td> BDH0262 </td></tr><tr><td> Eggeplomme emulsjon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 17148 </td></tr><tr><td> ME 2 membran vakuumpumpe </td><td> Vacuubrand </td><td> 696126 </td></tr><tr><td> Steritop filtre (Pore size: 0,22 mikrometer, nakke størrelse: 45 mm) </td><td> Millipore </td><td> SCGPT10RE </td></tr><tr><td> Luria-Bertani medium </td><td> Sigma </td><td> L2897 </td></tr><tr><td> 96-brønners mikrotiterplater </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581 </td></tr><tr><td> 24-brønnen vevskultur-behandlede plater </td><td> Iwaki </td><td> 3820-024 </td></tr><tr><td> CampyGen gass generasjon pakker </td><td> Oxoid </td><td> CN0025 </td></tr><tr><td> Mikroaerofile kammer </td><td> Oxoid </td><td> HP0011 </td></tr><tr><td> Tobramycin sulfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1783 </td></tr><tr><td> Cellulase, fra Aspergillus niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 22178 </td></tr><tr><td> Resazurin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 199303 </td></tr><tr><td> Citrate.H 2 0 </td><td> BDH </td><td> BDH0288 </td></tr><tr><td> Fluostar omega mikroplateleser </td><td> BMG-LabTech </td><td> SPECTROstar Omega </td></tr></tbody></table>

use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung

Det er økende bekymring om relevansen av in vitro antimikrobielle mottakelighet tester når den brukes til isolater av P. aeruginosa fra cystisk fibrose (CF) pasienter. Eksisterende metoder stole på én eller noen få isolater vokst aerobt og planktonically. Forhåndsbestemt cut-offs brukes til å definere om bakteriene er følsomme eller resistente mot et gitt antibiotikum en. Men under kroniske lungeinfeksjoner i CF, P. aeruginosa populasjoner finnes i biofilmer og det er bevis på at miljøet er stort sett mikroaerofile to. Den brutale forskjellen i forhold mellom bakterier i lungene og de ​​som i løpet av diagnostisk testing har kalt inn spørsmålet pålitelighet og selv relevansen av disse testene 3. Kunstig sputum medium (ASM) er en kultur medium som inneholder komponenter av CF pasient sputum, inkludert aminosyrer, mucin og gratis DNA. P. aeruginosa &lt;/ Em&gt; vekst i ASM etterligner vekst i CF infeksjoner, med dannelsen av egen tilsammen biofilm strukturer og befolkning divergens 4,5,6. Målet med denne studien var å utvikle en microtitre-plate analysen å studere antimikrobiell følsomhet P. aeruginosa basert på vekst i ASM, som gjelder både mikroaerofile og aerobe forhold. En ASM analysen ble utviklet i en microtitre plate format. P. aeruginosa biofilmer fikk lov til å utvikle for 3 dager før inkubasjon med antimikrobielle midler på ulike konsentrasjoner i 24 timer. Etter biofilm avbrudd, ble celleviabilitet målt ved farging med resazurin. Denne analysen ble brukt til å fastslå fastsittende cellen minste hemmende konsentrasjon (SMIC) av tobramycin for 15 ulike P. aeruginosa isolater under aerobe og mikroaerofile forhold og SMIC verdier ble sammenlignet med de som oppnås med standard kjøttkraft vekst. Mens det varnoen bevis for økte MIC verdier for isolater dyrket i ASM i forhold til sine planktoniske kolleger, ble de største forskjellene fant med bakteriene som ble testet i mikroaerofile forhold, som viste en mye økt motstand opp til a&gt; 128 fold, mot tobramycin i ASM systemet når sammenlignet med analyser utført i aerobe forhold. Mangelen på sammenheng mellom dagens resistenstesting metoder og klinisk resultat har stilt spørsmål ved gyldigheten av dagens metoder 3. Flere in vitro modeller har blitt brukt tidligere for å studere P. aeruginosa biofilmer 7, 8. Men disse metodene er avhengige av overflaten festet biofilm, mens ASM biofilm likner som er observert i CF lunge 9. I tillegg har redusert oksygenkonsentrasjon i slimet vist seg å endre atferden til P. aeruginosa 2 og påvirke antibiotika mottakelighet 10. Derfor using ASM henhold mikroaerofile forhold kan gi en mer realistisk miljø der for å studere antimikrobiell følsomhet.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung at JoVE.com

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Gjeldende diagnostiske antimikrobiell resistenstesting er avhengig av planktoniske veksten av isolater i næringsrike, aerobic forhold. Her benytter vi en alternativ kunstig spytt medium for å studere antimikrobiell følsomhet Pseudomonas aeruginosa biofilm under begge aerobe og mikroaerofile forholdene mer representative for cystisk fibrose lunge.

Bruk av kunstig Oppspytt Medium til Test antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Forhold mer relevant for Cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luftveisinfeksjon i Mus

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

En robust Lungebetennelse Modell hos immunkompetente Gnagere å evaluere Antibakteriell effekt mot<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; eller<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

En IL-8 Transient Transgenized Mouse Model for<em&gt; In vivo</em&gt; Langsiktig overvåking av inflammatoriske responser

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

En metode for å teste effekten av håndvask for fjerning av nye smittsomme patogener

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Kommer til lys Side: I Vivo overvåking av Pseudomonas aeruginosa Biofilm infeksjoner i kroniske sår i en diabetiker Hairless Murine modell

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overekspresjon og rensing av menneske<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Metoder for å oppdage cytotoksisk Amyloids følgende infeksjon av lunge endotelceller av Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...