Name: use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung
Uploaded: 2012-06-05T12:00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung at JoVE.com

Vi erkänner stöd av Förenade kungarikets National Institute for Health Research, Dr Hadwen Trust för Humane Research, Storbritanniens ledande medicinsk forskning välgörenhet finansiering uteslutande utan djurförsök tekniker för att ersätta djurförsök, och Wellcome Trust (Grant 089.215). Vi erkänner också Novartis Pharmaceuticals Storbritannien Ltd (obegränsad utbildningsbidrag).

1. Beredning av artificiell Sputum Medium (ASM) <ol><li> Tillsätt 4 g DNA från fiskspermier till 250 ml sterilt vatten mycket långsamt under en period av flera timmar. DNA: t tar flera timmar för att fullständigt lösa och kan omrördes över natten vid rumstemperatur. </li><li> Tillsätt 5 g mucin från svin magen (typ II) långsamt till 250 ml sterilt vatten till dess att mucin hade löst sig fullständigt. Lösningen kan omröras över natten vid 4 ° C. </li><li> Lös 0,25 g av varje essentiella och icke-essentiella L-aminosyra, med undantag av L-tyrosin och L-cystein, i 100 ml sterilt vatten. Lös 0,25 g av L-cystein i 25 ml 0,5 M kaliumhydroxid (M ^ 56,11 g / mol) och 0,25 g L-tyrosin i 25 ml sterilt vatten. </li><li> Lös 5,9 mg dietylen-triaminpentaättiksyra (DTPA), 5 g NaCl och 2,2 g KCl i 100 ml sterilt vatten. </li><li> Kombinera DNA-, mucin, L-aminosyror, DTPA, NaCl och KCl i en 1 liter kolv. </li><li> Tillsätt 5 ml av äggula emulsion och fyllning till cirka 850 ml med sterilt vatten. </li><li> Justera pH till 6,9 med 1 M Tris (pH 8,5; M ^ 121,14) och justera volymen till 1 liter med sterilt vatten. </li><li> Sterilisera ASM genom filtrering med användning av en Vacuubrand ME 2 diafragma vakuumpump och Millipore Steritop filterenheter med en por-och hals storlek av 0,22 pm och 45 mm, respektive. Varje Steritop filterenhet kan återanvändas direkt upp till tre gånger, men filtren måste sköljas två gånger med sterilt vatten innan de används igen. Filtreringsprocessen är långsam och kan utföras under 2 dagar. Andra versioner av ASM har utvecklats som använder tillsats av antibiotika i stället för filtrering 11 men på grund av eventuella läkemedelsinteraktioner, rekommenderar vi inte metoden för denna applikation. </li><li> Ofiltrerad och filtrerades ASM bör förvaras vid 4 ° C i mörker. Med färska ASM rekommenderas kan dock hållas under dessa förhållanden för högst en månad. </li&gt; </ol> 2. Fastställande av Planktonic fastsittande Cell minsta Metabolic hämmande koncentration (PSMIC) <ol><li> För att bestämma den lägsta metabola hämmande koncentration (PSMIC) värden för 15 planktonically vuxit P. aeruginosa isolat den mikroutspädningsmetoden bör utföras som beskrivs i riktlinjerna för den brittiska Society for Antimicrobial Chemotherapy BSAC 12. Den antibiotiska val, i detta fall tobramycin sulfat är seriespäddes i Luria-Bertani (LB) medium i en 96-brunnars mikrotiterplatta för att ge ett lämpligt intervall av antibiotiska koncentrationer. </li><li> Späd övernattskulturer av P. aeruginosa i LB till en OD 600 av 0,05 (± 0,01) och tillsätt 100 pl volymer till brunnarna av 96-brunnars mikrotiterplatta innehållande 100 | il av seriespädd antibiotikum. I detta fall, varierade de slutliga koncentrationerna av tobramycin-sulfat mellan 512 till 0,5 pg / ml. Åtta replikat av varje Antibiotic koncentration bör utföras. </li><li> Negativa kontrollbrunnar för varje isolat bör inrättas, där ingen antibiotika tillsätts. Dessutom bör åtta brunnar endast innehålla LB för användning som en tom under nedströms analys (avsnitt 2,6). </li><li> Inkubera 96-brunnars mikrotiterplattor under 1 - 2 dagar vid 37 ° C utan skakning under aeroba eller mikroaerofila (5% O2, 10% CO2, och 85% N2) betingelser. Mikroaerofila förhållanden erhålls med hjälp CampyGen förpackningar gasbildning stora anaeroba burkar. </li><li> Efter inkubation bakterietillväxt bestämdes genom mätning av absorbansen av den bakteriella kulturen i varje brunn vid en våglängd av 600 nm med användning av en Omega Fluostar mikroplattläsare och MARS Data Analysis Software. </li><li> Absorption från Antibiotikabehandlade planktoniska kulturerna (A antibiotika behandlade planktoniska celler) och absorption från de negativa kontrollerna (A negativ kontroll) bör korrigeras genom subtraktionjon av bakgrunden absorbans som erhållits från brunnar innehållande LB enbart (A blank). Den procentuella hämningen av livskraft därefter beräknas som (medelvärde ± antibiotika behandlade planktonceller / medelvärde En negativ kontroll) x 100%. Den PSMIC 90 definieras som den antibiotiska koncentrationen orsakar 90% inhibering av plankton bakterietillväxt. </li><li> För att bestämma bakteriell viabilitet efter behandling med antibiotika som föredras, 10 pl av 0,02% (volym / volym) resazurin (utspädd i destillerat vatten) tillsätts till varje brunn och plattorna inkuberades under aeroba betingelser under 1 till 2 h vid 37 ° C, under skakning vid 150 rpm. Livskraftiga celler kommer att minska den blå resazurin färgämnet till rosa fluorescerande resorufin form. </li><li> Efter inkubation med resazurin, övervaka fluorescensen av varje brunn med användning av en excitationsvåglängd av 540 nm och en emissionsvåglängd av 590 nm i en Fluostar omega mikroplattläsare. Uppgifterna skall analyseras som beskrivs ärlåg. </li></ol> 3. Bestämning av biofilm sessil Cell Minimal inhiberande koncentration (BSMIC) <ol><li> Nattgamla kulturer av P. aeruginosa (i detta fall är 15 isolat av P. aeruginosa som används) bör spädas i LB till ett OD 600 av 0,05 (± 0,01), sedan späddes ytterligare 1:100 i färsk ASM (total volym 1,8 ml). </li><li> De utspädda kulturer (1,8 ml) tillsättas till varje brunn i en 24-brunnars vävnads-behandlade odlingsplatta. Tre brunnar bör innehålla ASM endast för användning som en tom under nedströms analys (avsnitt 3,9). </li><li> Fästa de 24-brunnars plattor med laboratorium parafilm och inkubera under 3 dagar under aeroba eller mikroaerofila betingelser vid 37 ° C, under skakning vid 75 varv per minut. Mikroaerofila villkor bör uppnås med hjälp CampyGen förpackningar gasbildning stora anaeroba burkar. </li><li> Späd antibiotikum val, i detta fall tobramycin sulfat, att skapa en lämplig koncentrationsintervall i färsktASM. I detta fall sträckte slutkoncentrationer mellan 512 till 1 pg / ml. Tillsätt varje koncentration av antibiotikum, i volymer av 200 | il, till de lämpliga brunnarna i 24-brunnsplattor. Fyra replikat av varje antibiotikum koncentration bör utföras. Biofilmer som inte utsatts för den antibiotiska valda användes som en negativ kontroll. </li><li> Fästa de 24-brunnars plattor med laboratorium parafilm och inkuberas under aeroba eller mikroaerofila betingelser för en ytterligare 24 h vid 37 ° C, under skakning vid 75 varv per minut. </li><li> Efter inkubation i närvaro av antibiotikumet som föredras, stör de bakteriella biofilmer som använder 100 | il av 100 mg / ml cellulas (utspädd i 0,05 M citratbuffert [9,6 g / I Citrate.H 2 0 i vatten och pH-värdet till 4,6 med NaOH] ) och inkubera de 24-brunnsplattor under aeroba betingelser vid 37 ° C, under skakning vid 150 rpm under 1 timme. Om så krävs kan biofilmer kan ytterligare sönderdelas genom manuell pipettering i detta skede. </li><li> För att bestämma de metaboliska aktiviteterav de bakteriella cellerna frisatta från de sönderdelade biofilmer, resazurin (utspädd i destillerat vatten) 100 pl av 0,02% (volym / volym) tillsättas till varje brunn i 24-brunnars plattor och inkuberades under 1 - 2 h vid 37 ° C , under skakning vid 150 rpm. </li><li> Efter inkubation med resazurin, mäta fluorescensen i varje brunn med hjälp av en exciteringsvåglängd av 540 nm och en emissionsvåglängd av 590 nm i en Fluostar Omega mikroplattläsare och Mars Data Analysis Software. </li><li> Fluorescens från Antibiotikabehandlade biofilmer (F Antibiotikabehandlade biofilmer) och fluorescens från de negativa kontrollerna (F negativ kontroll) bör korrigeras genom subtraktion av bakgrundsfluorescens från brunnarna innehåller ASM bara (F blank). Den procentuella inhiberingen av viabilitet därefter beräknas som (medelvärde av F behandlade antibiotiska biofilmer / medelvärde F negativ kontroll) x 100%. Den BSMIC 90 definieras som den antibiotlc koncentration som orsakar 90% inhibering av den metaboliska aktiviteten. </li></ol> 4. Representativa resultat ASM biofilmbildning är möjligt i små (2 ml) volymer och biofilmen är helt formad i 3 dagar (figur 1A). Detta kan visas genom att strikt pipettering biofilmen, som bör vara svårt att störa. De mikrokolonier är jämförbara med de som odlas i större volymer 4 (figur 1B). Figur 2 visar stora skillnader mellan celler odlade planktonically och i en biofilm som detekteras av elektron mikroskopisk bildanalys. Biofilm kulturer visar tydligt avsevärda nivåer av extracellulär matrix som omger cellerna och individuella strukturer inom biofilmen är svåra att identifiera. Flera studier tyder på att biofilmen livsstil kan påverka antimikrobiell känslighet 13, 14. Det lilla skala ASM-analys kan användas för att DeTermine den BSMIC av multipla antibiotika för multipla isolat på samma gång. Arbetsflödet för analysen visas i Figur 3. Effekten av antibiotika på bakteriell cell livsduglighet kan mätas med användning av resazurin analysen. Antibiotika, i detta fall tobramycin, kan tillsättas till den etablerade biofilmen och inkuberades under 24 timmar. Efter detta biofilm avbryts och resazurin tillsätts. Metaboliskt aktiva celler kan reducera färgämnet resazurin resulterar i en färgförändring från blått (resazurin) till rosa (resorufin) 15. Figur 4A visar ett exempel analys i vilken P. aeruginosa inkuberades med olika koncentrationer av tobramycin före biofilmen störningar och tillsats av resazurin i en mikrotiterplatta. Den blå icke-fluorescerande färg indikerar icke livsdugliga celler, medan levande celler reducerar färgämnet till rosa fluorescerande form, resorufin. SMIC kan sedan beräknas genom att omvandla fluorescens i procentuellåterstående bakteriell livsduglighet. Figur 4B visar förändringen i% livsduglighet med ökande tobramycin koncentration. 10% viabilitet valdes som en cut-off för att beräkna SMIC 90. Under aeroba förhållanden, tobramycin SMIC 90 värden är högre för celler odlade i en biofilm än planktonceller kulturer. Tabell 1 visar variationen i PSMIC 90 och BSMIC 90 för alla testade isolaten. Tabell 2 visar att under aeroba betingelser, infördes en dramatisk ökning i resistens mot tobramycin (2 till&gt; 32-faldig ökning i SMIC) observerades för de flesta isolat när den odlas i ASM (biofilmen läge) jämfört med LB (planktoniska läge). Dessutom uppvisade biofilmer som odlats under mikroaerofila betingelser en ökad SMIC av mellan 2 och&gt; 128-faldig i jämförelse med biofilmen odlas under aeroba betingelser. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig1.jpg" /> Figur1. Biofilm bildning av P. aeruginosa i ASM P. aeruginosa stam PAO1 bildar makroskopiskt synliga klumpar (mikrokolonier) när de odlas i ASM. A biofilmbildning i 30 ml ASM kulturer (storskalig) efter 7 dagars tillväxt i skruvlock av glas Duran-kolvar. B biofilmbildning i 2 ml ASM kulturer ( småskalig) efter 3 dagars växt i 24-brunnars polystyrenplattor. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig2.jpg" /> Figur 2. TEM mikrofotografier av ASM biofilmer A / C TEM mikroskop (x; 27.000) i PAO1 vuxit planktonically och ASM, respektive B / D TEM mikroskop (X57, 000) av PAO1grown planktoniska och ASM, respektive. Planktonically odlade bakterierna odlades över natten i LB-buljong. Biofilmer odlades under 7 dagar i 30 ml ASM kulturer. Svarta pilar hänför sig till celler inom biofilmen och stjärnor avser extracellulära utrymmen. Skalstrecken = 1im. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig3.jpg" /> Figur 3. Arbetsflöde för ASM biofilmen resistensbestämning analys. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig4.jpg" /> Figur 4. Användning av resazurin för bestämning av antibiotika susceptibiliteter Bakteriella celler inkuberades med olika koncentrationer av antibiotikumet och den återstående metaboliska aktiviteten bestämdes med användning av resazurin. A indikerar Den blå icke-fluorescerande oxiderad form av resazurin icke-viabla celler och reduceras genom metabolisk aktiva celler till rosa fluorescerande resorufin. B, Fluorescensintensitet omvandlas till andel av kvarvarande bakterier livskraft. 10% viabilitet valdes som cut-off för att beräkna MSMIC90. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3857/3857fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se LAR</a>Ger figur. </span&gt; <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> Stammar </td><td colspan="2"> PSMIC 90 (ig / ml) 1 </td><td colspan="2"> BSMIC 90 (ig / ml) 1 </td></tr><tr><td> Aerob </td><td> Mikroaerofil 2 </td><td> Aerob </td><td> Mikroaerofil 2 </td></tr><tr><td> PAO1 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 8 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td colspan="5"> Liverpool epidemisk stam (LES) isolerar </td></tr><tr><td> LESB58 21 </td><td> 8 </td><td> 64 </td><td> 64 </td><td> 128 </td></tr><tr><td> LES400 22 </td><td> 32 </td><td> 128 </td><td> 8 </td><td> 256 </td></tr><tr><td> LESB25 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 256 </td><td> 512 </td></tr><tr><td> LESB55 </td><td> 16 </td><td> 64 </td><td> 64 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> LESB64 </td><td> 16 </td><td> 64 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> LES431 22 </td><td> 4 </td><td> 8 </td><td> 32 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> LESB49 </td><td> 16 </td><td> 64 </td><td> 64 </td><td> 256 </td></tr><tr><td> LES109 </td><td> 32 </td><td> 128 </td><td> 32 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td colspan="5"> Icke-LES isolat </td></tr><tr><td> 49.461 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 16 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 59.032 </td><td> 0,5 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 59.073 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 59.076 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 32 </td><td> &gt; 512 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> 27 </td><td> 8 </td><td> 16 </td><td> 4 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 45 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 4 </td><td> &gt; 512 </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Känslighet P. aeruginosa till tobramycin. 1 För bestämning av PSMICs och BSMICs tobramycinkoncentrationer användes i 2-faldiga serieutspädningar sträcker från 512 till 0,5 pg / ml (n = 8 för varje koncentration) och 512 till 1 pg / ml (n = 4 för varje koncentration), respektive;; PSMICs bestämdes med användning av standarden mikroutspädningsmetoden 1. 2 mikroaerofila betingelser var 5% O2, 10% CO2 och 85% N2. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> Stam </td><td colspan="4"> PSMIC 90 / BSMIC 90 faldig förändring 1 </td></tr><tr><td> PSMIC aerob → PSMIC mikroaerofil </td><td> BSMIC aerob → BSMIC mikroaerofil </td><td> PSMIC aerob → BSMIC aerob </td><td> PSMIC mikroaerofil → BSMIC mikroaerofil </td></tr><tr><td> PAO1 </td><td> 0 </td><td> &gt; 64 </td><td> 2 </td><td> 128 </td></tr><tr><td colspan="5"> LES isolerar </td></tr><tr><td> LESB58 </td><td> 8 </td><td> 2 </td><td> 8 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> LES400 </td><td> 4 </td><td> 32 </td><td> 0,25 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> LESB25 </td><td> 2 </td><td> 2 </td><td> 16 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> LESB55 </td><td> 4 </td><td> &gt; 8 </td&gt; <td> 4 </td><td> &gt; 8 </td></tr><tr><td> LESB64 </td><td> 4 </td><td> ND </td><td> &gt; 32 </td><td> &gt; 8 </td></tr><tr><td> LES431 </td><td> 2 </td><td> &gt; 16 </td><td> 8 </td><td> &gt; 64 </td></tr><tr><td> LESB49 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> LES109 </td><td> 4 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> &gt; 4 </td></tr><tr><td colspan="5"> Icke-LES isolat </td></tr><tr><td> 49.461 </td><td> 2 </td><td> &gt; 32 </td><td> 0 </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> 59.032 </td><td> 4 </td><td> &gt; 128 </td><td> 8 </td><td> &gt; 256 </td></tr><tr><td> 59.073 </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td></tr><tr><td> 59.076 </td><td> 2 </td><td> &gt; 16 </TD&gt; <td> 2 </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 2 </td><td> &gt; 128 </td><td> 0,5 </td><td> &gt; 32 </td></tr><tr><td> 45 </td><td> 2 </td><td> &gt; 128 </td><td> 0,25 </td><td> &gt; 16 </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Vik förändring av PSMICs och BSMICs till tobramycin. 1 ND, inte fastställas, värderingar i fetstil anger SMIC gånger förändringar&gt; 10.

<ol>
	<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+(version+8).">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).</li><li>Worlitzsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).</li><li>Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+testing+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+and+clinical+response+to+parenteral+antibiotic+administration:+lack+of+association+in+cystic+fibrosis.">Susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates and clinical response to parenteral antibiotic administration: lack of association in cystic fibrosis.</a> Chest. 123, 1495-1502 (2003).</li><li>Sriramulu, D. D., Lunsdorf, H., Lam, J. S., Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcolony+formation:+a+novel+biofilm+model+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+the+cystic+fibrosis+lung.">Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung.</a> J. Med. Microbiol. 54, 667-676 (2005).</li><li>Garbe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+JG024,+a+pseudomonas+aeruginosa+PB1-like+broad+host+range+phage+under+simulated+infection+conditions.">Characterization of JG024, a pseudomonas aeruginosa PB1-like broad host range phage under simulated infection conditions.</a> BMC Microbiol. 10, 301 (2010).</li><li>Naughton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+AES-1+exhibits+increased+virulence+gene+expression+during+chronic+infection+of+cystic+fibrosis+lung.">Pseudomonas aeruginosa AES-1 exhibits increased virulence gene expression during chronic infection of cystic fibrosis lung.</a> PLoS One. 6, e24526 (2011).</li><li>Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J. C., Gibson, R. L., Burns, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pseudomonas+biofilm+susceptibilities+to+assign+simulated+antibiotic+regimens+for+cystic+fibrosis+airway+infection.">Use of Pseudomonas biofilm susceptibilities to assign simulated antibiotic regimens for cystic fibrosis airway infection.</a> J. Antimicrob. Chemother. 56, 879-886 (2005).</li><li>Field, T. R., White, A., Elborn, J. S., Tunney, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oxygen+limitation+on+the+in+vitro+antimicrobial+susceptibility+of+clinical+isolates+of+Pseudomonas+aeruginosa+grown+planktonically+and+as+biofilms.">Effect of oxygen limitation on the in vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa grown planktonically and as biofilms.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 24, 677-687 (2005).</li><li>Bjarnsholt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+in+the+respiratory+tract+of+cystic+fibrosis+patients.">Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients.</a> Pediatr. Pulmonol. 44, 547-558 (2009).</li><li>Hill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+susceptibilities+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+derived+from+patients+with+cystic+fibrosis+under+aerobic,+anaerobic,+and+biofilm+conditions.">Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).</li><li>Fung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+mucin-containing+synthetic+growth+medium+mimicking+cystic+fibrosis+lung+sputum.">Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum.</a> J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).</li><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+(version+8).">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).</li><li>Rybtke, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+implication+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+in+infections.">The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections.</a> Inflamm Allergy Drug Targets. 10, 141-157 (2011).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway.">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 21, 595-599 (2008).</li><li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rapid+and+simple+non-radioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes:+an+alternative+to+[3H]thymidine+incorporation+assay.">A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> J. Immunol. Methods. 170, 211-224 (1994).</li><li>Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+antibiotic+treatment+on+bacteriophage+production+by+a+cystic+fibrosis+epidemic+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Effect of antibiotic treatment on bacteriophage production by a cystic fibrosis epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 55, 426-428 (2011).</li><li>Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum-sensing+signals+indicate+that+cystic+fibrosis+lungs+are+infected+with+bacterial+biofilms.">Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms.</a> Nature. 407, 762-764 (2000).</li><li>Mowat, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+Aeruginosa+Population+Diversity+and+Turnover+in+Cystic+Fibrosis+Chronic+Infections.">Pseudomonas Aeruginosa Population Diversity and Turnover in Cystic Fibrosis Chronic Infections.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. Med. , (2011).</li><li>Fothergill, J. L., Mowat, E., Ledson, M. J., Walshaw, M. J., Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+phenotypes+and+genotypes+within+populations+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+cystic+fibrosis+lung+during+pulmonary+exacerbations.">Fluctuations in phenotypes and genotypes within populations of Pseudomonas aeruginosa in the cystic fibrosis lung during pulmonary exacerbations.</a> J. Med. Microbiol. 59, 472-481 (2010).</li><li>Fouhy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusible+signal+factor-dependent+cell-cell+signaling+and+virulence+in+the+nosocomial+pathogen+Stenotrophomonas+maltophilia.">Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia.</a> J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).</li><li>Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+introduced+genomic+prophage+islands+are+critical+determinants+of+in+vivo+competitiveness+in+the+Liverpool+Epidemic+Strain+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Genome Res. 19, 12-23 (2009).</li><li>Carter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subtype+of+a+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+epidemic+strain+exhibits+enhanced+virulence+in+a+murine+model+of+acute+respiratory+infection.">A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection.</a> J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

I denna studie använde vi en ny in vitro modell baserad på ASM att replikera P. aeruginosa biofilm villkoren inom CF lungan 4. Modellen ändrades framgångsrikt för småskalig, hög genomströmning testning av antimikrobiella medel. De kritiska stegen i denna analys är följande: <ol><li> Konsekvent beredning av ASM media och upprätthålla sterilitet. Vi har ägnat långa timmar för att optimera det sätt på vilket varje komponent tillsätts för att uppnå reproducerbara resultat varje gång. Filtrering av ASM är långsam men är att föredra att autoklavering, vilket kan skada den mucin komponenten. Vi rekommenderar inte tillägg av antibiotika, som föreslås av andra 11, eftersom detta kan medföra betydande selektiva tryck, driv mutationer, framkalla profagen lys 16 och signifikant ändra uttrycket av flera bakteriella gener. </li><li> Analysen bör optimeras beroende på omfattning of ASM användas. Skakningar hastigheter höjs för mindre volymer och kortare biofilm livscykel observeras. </li></ol> En uppenbar tillämpning av småskalig ASM biofilm modell är mer realistisk bestämning av biofilm antimikrobiella känslighet (BSMIC 90). Anaeroba och mikroaerofila nischer finns i CF lungan och det finns bevis för att syre är begränsad djupt inom mogna biofilmer 2, 17. Här visar vi att 10/14 klinisk P. aeruginosa isolat från CF patienter sputa uppvisar en betydande (4 - ≥ 128 gånger) minskning i känslighet för tobramycin i mikroaerofila förhållanden i ASM. Resultaten av denna studie antyder att antibiotika, såsom tobramycin, kan vara mindre effektiva mot P. aeruginosa infektioner i CF lungan än vad som anges med konventionella metoder resistensbestämning. Dessa resultat återspeglar tidigare studier om antimikrobiella känsligheten hos biofilmer 10. Litenskala ASM analyser ger därmed en enkel hög genomströmning plattform för att generera meningsfulla antibiotikakänslighet data för att bättre informera terapeutiska beslut. Analysen är begränsad på samma sätt som traditionell antibiotikabehandling resistensbestämning i att enstaka kolonier plockas för screening som kanske inte är representativa för hela befolkningen. Vi tror dock att ett tillvägagångssätt (i) att använda icke-ytan bifogade biofilm tillväxt och (ii) för mikroaerofila förhållanden, utgör ett tydligt alternativ och en potentiell förbättring av befintliga metoder. Vi drar slutsatsen att denna analys är en lämplig modell för att studera P. aeruginosa biofilm populationer. Ytterligare testning i kliniska skulle avgöra om antibiotika känslighet baserat på biofilmen odlade P. aeruginosa kan leda till olika antibiotika val med potentiellt förbättrade mikrobiologiska och klinisk resultat. Liknande undersökningar med klassiska biofilm modeller har visat att BSMIC värden ledertill olika rekommendationer för antibiotikabehandling 5,17. Förutom testning för effektiviteten av anti-infektiösa agens utgör ASM systemet en billig, enkel och reproducerbar alternativ till djurmodeller för studier som de syftar till att förstå diversifiering av P. aeruginosa populationer. Vi har observerat en omfattande heterogenitet i naturliga populationer av P. aeruginosa återhämtat sig från CF patienter sputa 18, 19. Liknande fenotypiska och genotypiska diversifiering kan observeras under tillväxt i ASM 4 (och våra opublicerade data), vilket gör det till ett attraktivt in vitro modell av CF lung villkoren. Den relativa enkelhet ASM-modellen gör det enkelt att utforma långsiktiga anpassning försök riktar sig till, till exempel att övervaka effekterna av antibiotika eller andra påfrestningar på P. aeruginosa befolkningen divergens. Dessutom kan andra bakteriella patogener odlas iASM. Till exempel Fouhy et al. 2007 har använt ASM för att studera biofilm bildning av S. maltophillia 20.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DNA från fisk spermier </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74.782 </td></tr><tr><td> Mucin från gris mage, typ II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2378 </td></tr><tr><td> L-Alanin </td><td> Acros Organics </td><td> 102830250 </td></tr><tr><td> L-Arginin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5006 </td></tr><tr><td> L (+)-asparagin-monohydrat </td><td> Acros Organics </td><td> 175271000 </td></tr><tr><td> L (+)-asparaginsyra </td><td> Acros Organics </td><td> 105041000 </td></tr><tr><td> L-Cystein </td><td> Sigma-Adrich </td><td> 168.149 </td></tr&gt; <tr><td> L (+)-glutaminsyra </td><td> Acros Organics </td><td> 156211000 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td></tr><tr><td> Glycin </td><td> Acros Organics </td><td> 220911000 </td></tr><tr><td> L-histidin </td><td> Sigma-Adrich </td><td> H8000 </td></tr><tr><td> L-isoleucin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2752 </td></tr><tr><td> L-Leucin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L8000 </td></tr><tr><td> L (+)-lysin-monohydroklorid </td><td> Acros Organics </td><td> 125222500 </td></tr><tr><td> L-metionin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9625 </td></tr><tr><td> L-Fenylalanin </td><td> Acros Organics </td><td> 130310250 </td></tr><tr><td> L-prolin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380 </td></tr><tr><td> L-serin </td><td> Acros Organics </td><td> 132660250 </td></tr><tr><td> L-treonin </td><td> Acros Organics </td><td> 138930250 </td></tr><tr><td> L (-)-tryptofan </td><td> Acros Organics </td><td> 140590250 </td></tr><tr><td> L-tyrosin </td><td> Acros Organics </td><td> 140641000 </td></tr><tr><td> L-Valin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V0500 </td></tr><tr><td> Dietylentriaminpentaättiksyra </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 32.318 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S/3160/60 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> BDH </td><td> BDH0258 </td></tr><tr><td&gt; KOH </td><td> BDH </td><td> BDH0262 </td></tr><tr><td> Äggula emulsion </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 17.148 </td></tr><tr><td> ME 2 membran vakuumpump </td><td> Vacuubrand </td><td> 696.126 </td></tr><tr><td> Steritop filter (porstorlek: 0,22 m, nacke storlek: 45 mm) </td><td> Millipore </td><td> SCGPT10RE </td></tr><tr><td> Luria-Bertani-medium </td><td> Sigma </td><td> L2897 </td></tr><tr><td> 96-brunnars mikrotiterplattor </td><td> Sarstedt </td><td> 82,1581 </td></tr><tr><td> 24-brunnars vävnadsodlingsplatta-behandlade plattor </td><td> Iwaki </td><td> 3820-024 </td></tr><tr><td> CampyGen för alstring av gas förpackningar </td><td> Oxoid </td><td> CN0025 </td></tr><tr><td> Mikroaerofil kammare </td><td> Oxoid </td><td> HP0011 </td></tr><tr><td> Tobramycin-sulfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1783 </td></tr><tr><td> Cellulas, från Aspergillus niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 22.178 </td></tr><tr><td> Resazurin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 199.303 </td></tr><tr><td> Citrate.H 2 0 </td><td> BDH </td><td> BDH0288 </td></tr><tr><td> Fluostar omega mikroplattläsare </td><td> BMG-Labtech </td><td> SPECTROstar Omega </td></tr></tbody></table>

use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung

Det finns en växande oro för betydelsen av in vitro resistensbestämning tester när de tillämpas på isolat av P. aeruginosa av cystisk fibros (CF) patienter. Existerande metoder förlitar sig på enkel eller några isolat odlades aerobt och planktonically. Förutbestämda cut-off används för att definiera om bakterierna är känsliga eller resistenta mot en viss antibiotika 1. Under kroniska lung infektioner i CF, P. aeruginosa populationer finns i biofilmer och det finns belägg för att miljön är i stort sett mikroaerofila 2. Den markanta skillnaden i förutsättningar mellan bakterier i lungan och de som under diagnostiska tester har ifrågasatt tillförlitligheten och även betydelsen av dessa tester 3. Artificiell sputum medium (ASM) är ett odlingsmedium som innehåller komponenter av CF patientens sputum, inklusive aminosyror, mucin och gratis DNA. P. aeruginosa &lt;/ Em&gt; tillväxt i ASM härmar tillväxt under CF infektioner, med bildandet av själv samlar biofilm strukturer och befolkningens divergens 4,5,6. Syftet med denna studie var att utveckla en mikro-platta analys för att studera antimikrobiell känslighet P. aeruginosa baserat på tillväxt i ASM, som är tillämplig på både mikroaerofila och aeroba förhållanden. En ASM analys utvecklades i en mikrotiterplatta format. P. aeruginosa biofilmer fick utvecklas under 3 dagar före inkubation med antimikrobiella medel vid olika koncentrationer under 24 timmar. Efter biofilm störningar, var cellviabiliteten mättes genom färgning med resazurin. Denna analys användes för att fastställa den fastsittande celler minsta inhiberande koncentrationen (SMIC) av tobramycin för 15 olika P. aeruginosa isolat under aeroba och mikroaerofila förhållanden och SMIC värden jämfördes med de som erhölls med standard-buljong tillväxt. Även om det fannsvissa bevis för ökade MIC-värden för isolat odlas i ASM jämfört med sina planktoniska motsvarigheter, var de största skillnaderna finns med bakterier testade mikroaerofila förhållanden, som visade ett mycket ökat motstånd upp till en&gt; 128 gånger, mot tobramycin i ASM systemet när jämfört med analyser som utförs i aeroba betingelser. Bristen på koppling mellan nuvarande metoder resistensbestämning, och kliniskt resultat har ifrågasatt giltigheten av nuvarande metoder 3. Flera in vitro-modeller har använts tidigare för att studera P. aeruginosa biofilmer 7, 8. Men dessa metoder är beroende av ytan bifogade biofilmer, medan ASM biofilmen liknar de som observerats i CF lungan 9. Dessutom har minskad syrekoncentration i slem visats påverka beteendet hos P. aeruginosa 2 och påverka antibiotikakänslighet 10. Därför using ASM i mikroaerofila förhållanden kan ge en mer realistisk miljö att studera antimikrobiell känslighet.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung at JoVE.com

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Nuvarande diagnostiska resistensbestämning bygger på plankton tillväxt isolat i näringsrika och aeroba förhållanden. Här använder vi ett alternativt artificiellt sputum medium för att studera antimikrobiell känslighet Pseudomonas aeruginosa biofilmer under både aeroba och mikroaerofila förhållanden mer representativa för cystisk fibros lungan.

Användning av artificiell Sputum Medium för att testa antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I villkor som är mer relevanta för cystisk fibros Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa och Saccharomyces cerevisiae biofilm i Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolering av Pseudomonas aeruginosa Kolonisera Murine mag-tarmkanalen

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Långsiktig Kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway infektion hos möss

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

En robust Lunginflammation Model Immunokompetenta Gnagare att utvärdera Antibakteriell effekt mot<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; eller<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

En IL-8 Transient Transgenized Mouse Model för<em&gt; In vivo</em&gt; Långvarig övervakning av inflammatoriska reaktioner

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

En metod för att testa effekten av handtvätt för avlägsnande av nya smittsamma patogener

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Komma till den ljus sidan: In Vivo övervakning av Pseudomonas aeruginosa Biofilm infektioner i kroniska sår i en diabetiker hårlösa murina modell

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overuttryck och rening av människa<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferas i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Metoder för att upptäcka cytotoxiska amyloid följande infektion av pulmonell Endothelial celler av Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...