Name: microrna detection in prostate tumors by quantitative real-time pcr (qpcr)
Uploaded: 2012-05-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af den canadiske Cancer Society Research Institute, ikke give. 019038.

<html> 1. Prostata Prøvetagning <ol><li> Saml prostata prøverne på tidspunktet for prostatektomi. Prøven er orienteret ved hjælp af anatomiske vartegn. Den prostata og sædblærer er malet som følger: højre side grøn, venstre side blå. </li><li> En tilfældig tværgående midtersektion prostata er taget vinkelret på den rektale overflade, frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C 9. </li><li> Opsparede skiver af enhederne fotokopiering, orienteret (anterior, posterior, højre og venstre...

<ol>
	<li>Reinhart, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+plants.">MicroRNAs in plants.</a> Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).</li><li>Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+microRNA+Mir-14+suppresses+cell+death+and+is+required+for+normal+fat+metabolism.">The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism.</a> Curr. Biol. 13, 790 (2003).</li><li>Bueno, M. J., Perez, d. e. C. a. s. t. r. o., I, ., Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+proliferation+pathways+by+microRNAs.">Control of cell proliferation pathways by microRNAs.</a> Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).</li><li>Friedman, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92 (2009).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-281 (2004).</li><li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+microRNA+dysregulation+in+cancer.">Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 704 (2009).</li><li>Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+prostate+cancer.">MicroRNAs and prostate cancer.</a> Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).</li><li>Gordanpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-221+Is+down-regulated+in+TMPRSS2:ERG+fusion-positive+prostate+cancer.">miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer.</a> Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).</li><li>Nam, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+TMPRSS2:ERG+fusion+gene+predicts+cancer+recurrence+after+surgery+for+localised+prostate+cancer.">Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer.</a> Br. J. Cancer. 97, 1690 (2007).</li><li>Ambs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer.">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68, 6162 (2008).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-34a+inhibits+prostate+cancer+stem+cells+and+metastasis+by+directly+repressing+CD44.">The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44.</a> Nat. Med. 17, 211 (2011).</li></ol>

Afvigende udtryk nogle miRNA har konsekvent fundet i prostatatumorer i forhold til normalt væv 10, og nogle af disse miRNA blevet nævnt som potentielle hidtil ukendte terapeutiske midler mod prostatacancer 11. Derfor de afvigende ekspressionsniveauerne af miRNA kan være nyttige diagnostiske og / eller prognostisk biomarkører. Real-Time qPCR metode præsenteret her giver en analyse for nøjagtig kvantificering af miRNA niveauer i prostata tumorvæv. Den miScript PCR anvendt Systemet kan detekter...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td></tr><tr><td> TRIzol Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 15596 </td></tr><tr><td> miScript Revers transkription Kit </td><td> Qiagen </td><td> 218061 </td></tr><tr><td> miScript Primer Analyser </td><td> Qiagen </td><td> Eksperimenter specifikke </td></tr><tr><td> miScript SYBR Green PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 218073 </td></tr><tr><td> LightCycler 3,5 Real-Time PCR System </td><td> Roche </td><td></td></tr><tr><td> Light Cycler Kapillærer </td><td> Roche </td><td> 04929292001 </td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 spektrofotometer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 2538 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> G2943CA </td><td></td></tr></tbody></table>

microrna detection in prostate tumors by quantitative real-time pcr (qpcr)

MicroRNA (miRNA) er enkeltstrenget, 18-24 nucleotid lange, ikke-kodende RNA-molekyler. De er involveret i stort set alle cellulær proces, herunder udvikling 1, apoptose 2, og cellecyklus regel 3. MiRNA anslås at regulere ekspressionen af 30% til 90% af humane gener 4 ved binding til deres mål-messenger-RNA&#39;er (mRNA&#39;er) 5. Udbredt dysregulering af miRNA er blevet rapporteret i forskellige sygdomme og cancer undertyper 6. På grund af deres forekomst og unik struktur, disse små molekyler er sandsynligvis den næste generation af biomarkører, terapeutiske midler og / eller mål. Metoder til at undersøge miRNA udtryk omfatter SYBR grønne I farvestof-baserede samt Taqman-sonde baseret qPCR. Hvis miRNA der effektivt kan anvendes i den kliniske omgivelser, er det bydende nødvendigt, at deres opdagelse i friske og / eller arkiverede kliniske prøver være præcise, reproducerbare, og specific. qPCR har været meget anvendt til validering af ekspressionen af miRNA i hele genomet analyser, f.eks microarray studier 7. Prøverne, der anvendes i denne protokol var fra patienter, som gennemgik radikal prostatektomi for klinisk lokaliserede prostatacancer, men andre væv og cellelinier kan være substitueret ind Prostate prøver blev lynfrosset i flydende nitrogen efter resektion. Kliniske variable og opfølgende oplysninger for hver patient blev indsamlet til efterfølgende analyse 8. Kvantificering af miRNA niveauer i prostata tumorprøver. De vigtigste skridt i qPCR analyse af tumorer er: Total RNA ekstraktion, cDNA syntese, og afsløring af qPCR produkter ved hjælp af miRNA-specifikke primere. Totalt RNA, som omfatter mRNA, miRNA, og andre små RNA&#39;er blev ekstraheret fra prøver med TRIzol reagens. Qiagen s miScript blev anvendt til at syntetisere cDNA og udføre qPCR (figur 1). Endogene miRNA ikke polyadenylated derfor under revers transkription-processen, en poly (A)-polymerase polyadenylates miRNA. MiRNA anvendes som en template til at syntetisere cDNA under anvendelse af oligo-dT og revers transkriptase. En universel tag-sekvens i 5&#39;-enden af ​​oligo-dT-primere letter amplifikation af cDNA ved PCR trin. PCR-produktet amplifikation detekteres ved niveauet af fluorescens udsendt af SYBR Green, et farvestof, som interkalerer i dobbeltstrenget DNA. Specifikke miRNA primere, sammen med en universel primer, som binder til det universelle mærke sekvensen vil amplificere specifikke miRNA sekvenser. De miScript Primer analyser er tilgængelige for mere end et tusind menneske-specifikke miRNA, og hundredvis af murine-specifikke miRNA. Relativ kvantificering fremgangsmåde blev anvendt her til at kvantificere ekspressionen af ​​miRNA. For at korrigere for forskelle mellem forskellige prøver, er ekspressionsniveauer af et mål miRNA normaliseret til ekspressionsniveauer af en reference-gen. Valget af en GEne, hvorpå der kan normalisere ekspressionen af ​​mål er kritisk i relativ kvantificering analysemetode. Eksempler på referenceniveauer gener der typisk anvendes i denne egenskab er det lille RNA&#39;er RNU6B, RNU44 og RNU48 idet de anses for at være stabilt udtrykt i de fleste prøver. I denne protokol er RNU6B anvendes som reference-genet.

Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR at JoVE.com

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Kvantitativ realtids polymerasekædereaktion (qPCR) er en hurtig og følsom metode til at undersøge ekspressionsniveauerne af forskellige microRNA (miRNA) molekyler i tumorprøver. Anvendelse af denne fremgangsmåde ekspression af hundreder af forskellige miRNA molekyler kan forstærkes, kvantificeres, og analyseres fra det samme cDNA-skabelon.

MicroRNA Påvisning i prostata tumorer ved kvantitativ real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Research

JoVE Journal

Medicine

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical ...

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

A Real-time elektriske impedans Baseret Teknik til måling Invasionen af ​​Endotel cellemonolag ved kræftceller

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Detektion og Genogrouping af norovira fra børne Taburetter Ved Taqman Et-trins RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Heterogenitet Kortlægning af protein udtryk i tumorer ved hjælp af kvantitative Immunofluorescens

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identifikation af<em&gt; Tornerose</em&gt; Transposon Insertioner i solide tumorer med Linker-medieret PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Bevægelse Omskoling med Real-time feedback af Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Brug af kvantitativ real-time PCR til Bestem donorcelle indpodning i en konkurrencepræget murin knoglemarvstransplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Cerebrospinalvæske microRNA ved brug af kvantitativ real time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

Real-time cytotoksicitetsassays i humant fuldblod

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...