Name: microrna detection in prostate tumors by quantitative real-time pcr (qpcr)
Uploaded: 2012-05-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de Canadese Cancer Society Research Institute, toe te kennen nee. 019038.

<html> 1. Prostaat Sample Collection <ol><li> Verzamelen van de prostaat monsters bij de prostatectomie. Het monster wordt georiënteerd met behulp van anatomische oriëntatiepunten. De prostaat en zaadblaasjes zijn geschilderd als volgt: rechts groen, links blauw. </li><li> Een willekeurige dwars middendeel van de prostaat loodrecht op de rectale oppervlak, bevroren in vloeibare stikstof en bij -80 ° C 9. </li><li> Banked plakjes exemplaren zijn fotokopieën, gericht (anterior, posterior, rechts en links),...

<ol>
	<li>Reinhart, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+plants.">MicroRNAs in plants.</a> Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).</li><li>Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+microRNA+Mir-14+suppresses+cell+death+and+is+required+for+normal+fat+metabolism.">The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism.</a> Curr. Biol. 13, 790 (2003).</li><li>Bueno, M. J., Perez, d. e. C. a. s. t. r. o., I, ., Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+proliferation+pathways+by+microRNAs.">Control of cell proliferation pathways by microRNAs.</a> Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).</li><li>Friedman, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92 (2009).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-281 (2004).</li><li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+microRNA+dysregulation+in+cancer.">Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 704 (2009).</li><li>Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+prostate+cancer.">MicroRNAs and prostate cancer.</a> Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).</li><li>Gordanpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-221+Is+down-regulated+in+TMPRSS2:ERG+fusion-positive+prostate+cancer.">miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer.</a> Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).</li><li>Nam, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+TMPRSS2:ERG+fusion+gene+predicts+cancer+recurrence+after+surgery+for+localised+prostate+cancer.">Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer.</a> Br. J. Cancer. 97, 1690 (2007).</li><li>Ambs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer.">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68, 6162 (2008).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-34a+inhibits+prostate+cancer+stem+cells+and+metastasis+by+directly+repressing+CD44.">The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44.</a> Nat. Med. 17, 211 (2011).</li></ol>

Afwijkende uitingen van sommige miRNAs zijn consistent gevonden in de prostaat tumoren in vergelijking met normaal weefsel 10, en een aantal van deze miRNAs zijn genoemd als potentiële nieuwe therapeutische middelen tegen prostaatkanker 11. Vandaar de afwijkende expressie van miRNAs kan nuttig diagnostische en / of prognostische biomarkers. De Real-Time qPCR methodiek hier gepresenteerd biedt een test voor een nauwkeurige kwantificering van miRNA niveaus in de prostaat tumor weefsels. De miScript ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> TRIzol Reagent </td><td> Invitrogen </td><td> 15596 </td></tr><tr><td> miScript Reverse Transcription Kit </td><td> Qiagen </td><td> 218061 </td></tr><tr><td> miScript Primer Assays </td><td> Qiagen </td><td> Experiment specifieke </td></tr><tr><td> miScript SYBR Green PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 218073 </td></tr><tr><td> LightCycler 3.5 Real-Time PCR-systeem </td><td> Roche </td><td></td></tr><tr><td> Licht cycler Haarvaten </td><td> Roche </td><td> 04929292001 </td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 spectrofotometer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 2538 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> G2943CA </td><td></td></tr></tbody></table>

microrna detection in prostate tumors by quantitative real-time pcr (qpcr)

MicroRNA (miRNAs) zijn enkelstrengs 18-24 nucleotide lang niet-coderende RNA-moleculen. Ze zijn betrokken bij vrijwel elke cellulaire proces, inclusief ontwikkeling 1, apoptose 2, en celcyclus 3. MiRNAs worden geschat op de expressie van 30% te regelen tot 90% van de menselijke genen 4 door te binden aan hun doel messenger RNA (mRNA) 5. Wijdverbreide ontregeling van miRNAs is gemeld bij verschillende ziekten en kanker subtypes 6. Als gevolg van de prevalentie ervan en unieke structuur, deze kleine moleculen zijn waarschijnlijk de volgende generatie van biomarkers, therapeutische middelen en / of doelstellingen zijn. Methoden om aan te miRNA expressie onderzoeken zijn onder andere SYBR groene I dye-basis en Taqman-probe gebaseerde qPCR. Als miRNAs zijn om effectief te worden gebruikt in de klinische setting, is het noodzakelijk dat hun detectie in vers en / of gearchiveerd klinische monsters nauwkeurig, reproduceerbaar, en specific. qPCR is op grote schaal gebruikt voor het valideren van de expressie van miRNAs in hele genoom analyses, zoals microarray studies 7. De monsters in dit protocol van patiënten die waren radicale prostatectomie ondergaan voor klinisch gelokaliseerde prostaatkanker echter andere weefsels en cellijnen kunnen worden vervangen binnen prostaat monsters werden snel bevroren in vloeibare stikstof na verwijdering. Klinische variabelen en follow-up informatie voor elke patiënt werden verzameld voor latere analyse 8. Kwantificering van miRNA niveaus in de prostaat tumor monsters. De belangrijkste stappen in qPCR analyse van tumoren zijn: Totaal RNA-extractie, cDNA synthese, en detectie van qPCR producten met behulp van miRNA-specifieke primers. Totaal RNA, die mRNA, miRNA, en andere kleine RNA&#39;s bevat werden uit monsters met behulp van TRIzol reagens. Qiagen&#39;s miScript System werd gebruikt voor het synthetiseren van cDNA en qPCR (figuur 1) uit te voeren. Endogene miRNAs zijn niet polyadenylated, dus tijdens de omgekeerde transcriptie proces, een poly (A) polymerase polyadenylates de miRNA. De miRNA wordt gebruikt als een template voor de synthese van cDNA met oligo-dT en reverse transcriptase. Een universele tag volgorde van het 5&#39;-uiteinde van oligo-dT primers maakt de amplificatie van cDNA in de PCR-stap. PCR amplificatie product wordt waargenomen door de mate van fluorescentie afkomstig van SYBR Green, een kleurstof die intercalates in dubbelstrengs DNA. Specifieke miRNA primers, samen met een universele primer die bindt aan de universele tag volgorde zal versterken specifieke miRNA sequenties. De miScript Primer Testen zijn beschikbaar voor meer dan duizend mensen specifieke miRNAs, en honderden muizen-specifieke miRNAs. Relatieve kwantificering methode werd hier gebruikt om de expressie van miRNAs te kwantificeren. Om te corrigeren voor variatie tussen de verschillende monsters, is expressie van een doel miRNA genormaliseerd op de expressie van een referentie-gen. De keuze van een gene is om de expressie van doelen normaliseren kritisch relatieve kwantificatie analysemethode. Voorbeelden van genen referentie gewoonlijk in deze hoedanigheid de kleine RNA RNU6B, RNU44 en RNU48 omdat zij als stabiel uit te drukken in de meeste voorbeelden. In dit protocol wordt RNU6B als referentie-gen.

Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR at JoVE.com

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Kwantitatieve Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is een snelle en gevoelige methode om de expressie niveaus van verschillende microRNA (miRNA) moleculen te onderzoeken in tumor monsters. Met deze methode uitdrukking van honderden verschillende miRNA-moleculen kunnen worden versterkt, gekwantificeerd en geanalyseerd uit dezelfde cDNA sjabloon.

MicroRNA Detectie in prostaattumoren op Kwantitatieve Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Research

JoVE Journal

Medicine

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

Multispectrale Real-time Fluorescentie Imaging voor intra-operatief detectie van de schildwachtklier in gynaecologische oncologie

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical ...

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Een real-time elektrische Impedantie Gebaseerd Techniek om invasie van endotheelcellen monolaag meten door Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Detectie en Genogrouping van Norovirussen van Children&#39;s Krukken Door Taqman een stap RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Heterogeniteit in kaart brengen van de expressie van eiwitten in tumoren met behulp van kwantitatieve Immunofluorescentie

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identificatie van<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; Transposon inserties in vaste tumoren met Linker-gemedieerde PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Beweging Omscholing met behulp van real-time feedback van Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Met behulp van kwantitatieve real-time PCR voor donorcel Engraftment bepalen in een concurrerende Murine beenmergtransplantatie Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Cerebrospinale vloeistof MicroRNA Profiling Met behulp van kwantitatieve real time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

Real-time cytotoxiciteitsassays in humaan volbloed

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...