Name: microrna detection in prostate tumors by quantitative real-time pcr (qpcr)
Uploaded: 2012-05-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av kanadiske Cancer Society Research Institute, gi no. 019038.

<html> 1. Prostata Prøvetaking <ol><li> Samle prostata prøvene på tidspunktet for prostatektomi. Prøven er orientert med anatomiske landemerker. Prostata og sædblærene er malt slik: Høyre side grønn, venstre side blå. </li><li> Et tilfeldig tverrgående midsection av prostata er tatt vinkelrett mot endetarms overflaten, frosset i flytende nitrogen og oppbevart ved -80 ° C 9. </li><li> Banked skiver av prøver er kopierte, orientert (anterior, posterior, høyre og venstre), quadrisected. Seksjoner e...

<ol>
	<li>Reinhart, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+plants.">MicroRNAs in plants.</a> Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).</li><li>Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+microRNA+Mir-14+suppresses+cell+death+and+is+required+for+normal+fat+metabolism.">The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism.</a> Curr. Biol. 13, 790 (2003).</li><li>Bueno, M. J., Perez, d. e. C. a. s. t. r. o., I, ., Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+proliferation+pathways+by+microRNAs.">Control of cell proliferation pathways by microRNAs.</a> Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).</li><li>Friedman, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92 (2009).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-281 (2004).</li><li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+microRNA+dysregulation+in+cancer.">Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 704 (2009).</li><li>Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+prostate+cancer.">MicroRNAs and prostate cancer.</a> Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).</li><li>Gordanpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-221+Is+down-regulated+in+TMPRSS2:ERG+fusion-positive+prostate+cancer.">miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer.</a> Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).</li><li>Nam, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+TMPRSS2:ERG+fusion+gene+predicts+cancer+recurrence+after+surgery+for+localised+prostate+cancer.">Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer.</a> Br. J. Cancer. 97, 1690 (2007).</li><li>Ambs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer.">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68, 6162 (2008).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-34a+inhibits+prostate+cancer+stem+cells+and+metastasis+by+directly+repressing+CD44.">The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44.</a> Nat. Med. 17, 211 (2011).</li></ol>

Avvikende uttrykk for noen miRNAs har vært konsekvent funnet i prostatakreft sammenlignet med normalt vev 10, og noen av disse miRNAs har blitt navngitt som mulige nye terapeutiske midler mot prostatakreft 11. Derav avvikende uttrykk nivåer av miRNAs kan være nyttige diagnostiske og / eller prognostisk biomarkører. The Real-Time qPCR metodikk presentert her gir en analyse for nøyaktig kvantifisering av miRNA nivåer i prostata tumorvev. Det miScript PCR systemet som brukes kan oppdage single n...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> TRIzol Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 15596 </td></tr><tr><td> miScript Reverse Transcription Kit </td><td> Qiagen </td><td> 218061 </td></tr><tr><td> miScript Primer Analyser </td><td> Qiagen </td><td> Eksperiment spesifikk </td></tr><tr><td> miScript SYBR Grønn PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 218073 </td></tr><tr><td> LightCycler 3,5 Real-Time PCR System </td><td> Roche </td><td></td></tr><tr><td> Lys cycler kapillærer </td><td> Roche </td><td> 04929292001 </td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 spektrofotometer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 2538 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> G2943CA </td><td></td></tr></tbody></table>

microrna detection in prostate tumors by quantitative real-time pcr (qpcr)

MicroRNAs (miRNAs) er single-tvinnet, 18-24 nukleotid lange, ikke-kodende RNA-molekyler. De er involvert i praktisk talt alle cellulære prosessen inkludert en utvikling, apoptose 2, og cellesyklus regulering tre. MiRNAs er anslått å regulere uttrykket av 30% til 90% av menneskets gener 4 ved binding til sine mål messenger RNA (mRNA) 5. Utbredt feilregulering av miRNAs har blitt rapportert i ulike sykdommer og kreft subtyper 6. På grunn av sin utbredelse og unike struktur, disse små molekyler er sannsynligvis den neste generasjonen av biomarkører, terapeutiske agenter og / eller mål. Metoder som brukes til å undersøke miRNA uttrykk inkludere SYBR grønn jeg dye-basert samt Taqman-probe baserte qPCR. Hvis miRNAs er å være effektivt brukes i klinisk setting, er det viktig at deres oppdagelse i ferske og / eller arkiveres kliniske prøver være nøyaktig, reproduserbare, og specific. qPCR har blitt mye brukt for å validere uttrykk av miRNAs i hele genomet analyser som microarray studier 7. Prøvene brukes i denne protokollen var fra pasienter som gjennomgikk radikal prostatektomi for klinisk lokalisert prostatakreft, men andre vev og cellelinjer kan erstattes i. Prostata prøvene ble snap-frosset i flytende nitrogen etter reseksjon. Kliniske variabler og følge opp informasjon for hver pasient ble samlet for senere analyse åtte. Kvantifisering av miRNA nivåer i prostata tumorprøver. De viktigste trinnene i qPCR analyse av svulster er: Total RNA ekstraksjon, cDNA syntese, og påvisning av qPCR produkter med miRNA-spesifikke primere. Total RNA, som inkluderer mRNA, miRNA, og andre små RNA ble ekstrahert fra prøver med TRIzol reagens. Qiagen har miScript System ble brukt til å syntetisere cDNA og utføre qPCR (figur 1). Endogene miRNAs er ikke polyadenylated derfor under revers transkripsjon prosessen, polyadenylates en poly (A) polymerase den miRNA. Den miRNA brukes som en mal for å syntetisere cDNA ved hjelp av oligo-dT og revers transkriptase. En universell tag sekvens på 5 &#39;enden av oligo-dT primere forenkler forsterkningen av cDNA i PCR trinnet. PCR produkt forsterkning blir oppdaget av nivået av fluorescens slippes ut av SYBR Green, et fargestoff som intercalates inn dobbelt DNA. Spesifikke miRNA primere, sammen med en universal primer som binder seg til den universelle koden sekvensen vil forsterke spesifikke miRNA sekvenser. De miScript Primer Assays er tilgjengelig i over tusen menneske-spesifikke miRNAs og hundrevis av murine-spesifikke miRNAs. Relativ kvantifisering metoden ble brukt her for å kvantifisere uttrykk for miRNAs. For å korrigere for variasjon blant forskjellige prøver, er uttrykk nivåer av et mål miRNA normalisert til uttrykket nivåer av en referanse gen. Valget av en gene på å normalisere uttrykk for målene er kritisk i forhold kvantifisering metode for analyse. Eksempler på referansenummer gener som vanligvis brukes i denne kapasiteten er den lille RNAS RNU6B, RNU44, og RNU48 som de anses å være stabilt til uttrykk i de fleste prøvene. I denne protokollen, blir RNU6B brukt som referanse genet.

Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR at JoVE.com

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Kvantitativ Real Time polymerase chain reaction (qPCR) er en rask og følsom metode for å undersøke uttrykket nivåer av ulike mikroRNA (miRNA) molekyler i tumorprøver. Ved hjelp av denne metoden uttrykk for hundrevis av forskjellige miRNA molekyler kan forsterkes, kvantifiseres og analyseres fra samme cDNA mal.

MikroRNA Detection i prostatakreft ved Kvantitativ Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Research

JoVE Journal

Medicine

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical ...

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

A Real-time elektrisk impedans Basert teknikk for å måle Invasjonen av Endothelial cellemonoskiktet av kreftceller

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Påvisning og Genogrouping av noroviruses fra Barnas Avføring Av Taqman Ett-trinns RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Heterogenitet Kartlegging av Protein Expression i Svulster med Kvantitative immunfluorescens

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identifisering av<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; Transposon Innsettinger i solide svulster ved hjelp Linker-mediert PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Movement Omskolering ved Real-time Tilbakemelding of Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Bruke kvantitativ real-time PCR fastslår Donor Cell engraftment i en konkurransedyktig Murine benmargstransplantasjon Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Cerebrospinalvæsken MikroRNA Profilering Bruke Kvantitativ Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

Real-time cytotoksisitetsanalyser i humant fullblod

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...