Name: microrna detection in prostate tumors by quantitative real-time pcr (qpcr)
Uploaded: 2012-05-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pela Canadian Cancer Society Research Institute, conceder nenhuma. 019038.

<html> 1. Coleta de Amostras de próstata <ol><li> Recolher as amostras da próstata, no momento da prostatectomia. A amostra é orientada usando marcos anatômicos. A próstata e as vesículas seminais são pintadas como segue: verde do lado direito, azul lado esquerdo. </li><li> Um midsection aleatória transversal da próstata é tomada perpendicularmente à superfície rectal, congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C 9. </li><li> Bancados fatias de espécimes são fotocopiadas, orientado (ant...

<ol>
	<li>Reinhart, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+plants.">MicroRNAs in plants.</a> Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).</li><li>Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+microRNA+Mir-14+suppresses+cell+death+and+is+required+for+normal+fat+metabolism.">The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism.</a> Curr. Biol. 13, 790 (2003).</li><li>Bueno, M. J., Perez, d. e. C. a. s. t. r. o., I, ., Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+proliferation+pathways+by+microRNAs.">Control of cell proliferation pathways by microRNAs.</a> Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).</li><li>Friedman, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92 (2009).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-281 (2004).</li><li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+microRNA+dysregulation+in+cancer.">Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 704 (2009).</li><li>Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+prostate+cancer.">MicroRNAs and prostate cancer.</a> Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).</li><li>Gordanpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-221+Is+down-regulated+in+TMPRSS2:ERG+fusion-positive+prostate+cancer.">miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer.</a> Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).</li><li>Nam, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+TMPRSS2:ERG+fusion+gene+predicts+cancer+recurrence+after+surgery+for+localised+prostate+cancer.">Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer.</a> Br. J. Cancer. 97, 1690 (2007).</li><li>Ambs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer.">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68, 6162 (2008).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-34a+inhibits+prostate+cancer+stem+cells+and+metastasis+by+directly+repressing+CD44.">The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44.</a> Nat. Med. 17, 211 (2011).</li></ol>

Expressões aberrantes de alguns miRNAs foram consistentemente encontrados em tumores de próstata quando comparado com o tecido normal 10, e alguns destes miRNAs foram nomeados como potenciais novos agentes terapêuticos contra o cancro da próstata 11. Assim, os níveis de expressão aberrante de miRNAs podem ser úteis biomarcadores de diagnóstico e / ou prognóstico. A metodologia qPCR Real-Time aqui apresentado proporciona um ensaio para a quantificação precisa dos níveis de miRNA em tecid...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do o reagente de </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Reagente de TRIzol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596 </td></tr><tr><td> miScript Kit de Transcrição em reverssa </td><td> Qiagen </td><td> 218061 </td></tr><tr><td> miScript Assays Primer </td><td> Qiagen </td><td> Experiment específico </td></tr><tr><td> miScript SYBR Green PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 218073 </td></tr><tr><td> LightCycler 3,5 Real-Time Sistema de PCR </td><td> Roche </td><td></td></tr><tr><td> Luz Cycler Capilares </td><td> Roche </td><td> 04929292001 </td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 espectrofotômetro </td><td> Thermo Scientific </td><td> 2538 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> G2943CA </td><td></td></tr></tbody></table>

microrna detection in prostate tumors by quantitative real-time pcr (qpcr)

MicroRNAs (miRNAs) são de cadeia simples, 18-24 nucleótidos de comprimento, moléculas de RNA não codificantes. Eles estão envolvidos em praticamente todos os processos celulares, incluindo o desenvolvimento 1, 2 apoptose e regulação do ciclo celular 3. MiRNAs Estima-se que regulam a expressão de 30% a 90% de genes humanos 4 por ligação aos seus RNAs alvo mensageiro (ARNm) 5. Desregulação generalizada de miRNAs tem sido relatada em várias doenças cancerosas e subtipos 6. Devido à sua prevalência e estrutura única, estas moléculas pequenas são susceptíveis de ser a próxima geração de biomarcadores, agentes terapêuticos e / ou alvos. Os métodos utilizados para investigar a expressão de miRNA incluem SYBR green eu à base de corantes, bem como Taqman-sonda qPCR base. Se miRNAs estão a ser efetivamente utilizado na prática clínica, é imperativo que a sua detecção, frescos e / ou arquivados amostras clínicas ser preciso, reprodutível e specific. qPCR tem sido amplamente utilizado para validar a expressão de miRNAs em análises do genoma inteiro, tais como estudos microarray 7. As amostras utilizadas neste protocolo eram de pacientes que foram submetidos a prostatectomia radical para o cancro da próstata clinicamente localizado, no entanto outros tecidos e linhas celulares pode ser substituído pol espécimes de próstata foram snap-congelado em azoto líquido após a ressecção. As variáveis ​​clínicas e follow-up de informação para cada paciente foram coletadas para análise posterior 8. Quantificação dos níveis de miRNA em amostras de tumores de próstata. As etapas principais da análise qPCR de tumores são: a extracção de RNA total a síntese de cDNA, e detecção de produtos de qPCR usando miRNA primers específicos. O RNA total, que inclui mRNA, miRNA, e outros pequenos RNAs foram extraídos a partir de amostras utilizando reagente Trizol. Sistema da QIAGEN miScript foi utilizado para sintetizar ADNc e realizar qPCR (Figura 1). MiRNAs endógenos não são polyadenylated, portanto, durante o processo de transcrição reversa, uma polimerase de (A) poli polyadenylates o miRNA. O miRNA é utilizado como um modelo para sintetizar ADNc utilizando oligo-dT e transcriptase reversa. Uma sequência de etiqueta universal sobre a extremidade 5 &#39;de oligo-dT iniciadores facilita a amplificação de cDNA no passo de PCR. A amplificação por PCR do produto é detectado pelo nível de fluorescência emitida pelo SYBR Green, um corante que intercala em DNA de cadeia dupla. Primers específicos miRNA, juntamente com um Primer Universal que se liga à seqüência tag universal irá amplificar sequências específicas de miRNA. Os ensaios Primer miScript estão disponíveis para mais de mil humano miRNAs específicos e centenas de murino específicos miRNAs. Método de quantificação relativa foi usado aqui para quantificar a expressão de miRNAs. Para corrigir para a variabilidade entre diferentes amostras, níveis de expressão de um miRNA alvo é normalizado para os níveis de expressão de um gene de referência. A escolha de um geem que ne para normalizar a expressão de alvos é crítica na método de quantificação relativa de análise. Exemplos de genes de referência tipicamente usados ​​nesta capacidade são o RNU6B pequenos RNAs, RNU44, e RNU48 como eles são considerados ser estavelmente expressos na maior parte dos exemplos. Neste protocolo, RNU6B é usado como o gene de referência.

Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR at JoVE.com

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitativa em Tempo Real reacção em cadeia da polimerase (qPCR) é um método rápido e sensível para investigar os níveis de expressão de vários microRNA (miRNA) moléculas em amostras de tumor. Usando este método de expressão de centenas de moléculas miRNA diferentes pode ser amplificado, quantificado e analisado a partir do mesmo modelo cDNA.

Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Research

JoVE Journal

Medicine

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

Imagens em tempo real multiespectrais de fluorescência para detecção intra-operatória do linfonodo sentinela em Oncologia Ginecológica

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical ...

Medicina

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

A técnica de impedância elétrica em tempo real baseado medir Invasão de monocamada de células endoteliais por células cancerosas

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Avaliação de Captação de nanopartículas em tumores em tempo real usando imagens intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Detecção e Genogrouping de norovírus a partir de fezes das crianças, Taqman Um passo-RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Mapeamento de heterogeneidade de expressão da proteína em tumores usando imunofluorescência Quantitative

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identificação de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Inserções de transposões em tumores sólidos utilizando Linker mediada por PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Movimento Reciclagem com feedback em tempo real do desempenho

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Usando Quantitative PCR em tempo real para determinar enxerto célula dadora num modelo murino de osso Competitiva Marrow Transplantation

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Líquido cefalorraquidiano MicroRNA perfil usando Quantitative PCR em Tempo Real

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

Em tempo real de Citotoxicidade em Sangue Total Humano

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...