Name: microrna detection in prostate tumors by quantitative real-time pcr (qpcr)
Uploaded: 2012-05-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av den kanadensiska Cancer Society Research Institute, inte bevilja. 019.038.

<html> 1. Prostata Provtagning <ol><li> Samla upp prostata prover vid tiden för prostatektomi. Provet orienteras med anatomiska landmärken. Prostata och sädesblåsor är målade enligt följande: höger sida green, vänster sida blå. </li><li> Ett slumpmässigt tvärgående mittdelen av prostata tas vinkelrätt mot den rektala ytan, frystes i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C 9. </li><li> Cellbanker skivor exemplar är kopieras, orienterade (främre, bakre, höger och vänster), fyrsektioners. Se...

<ol>
	<li>Reinhart, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+plants.">MicroRNAs in plants.</a> Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).</li><li>Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+microRNA+Mir-14+suppresses+cell+death+and+is+required+for+normal+fat+metabolism.">The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism.</a> Curr. Biol. 13, 790 (2003).</li><li>Bueno, M. J., Perez, d. e. C. a. s. t. r. o., I, ., Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+proliferation+pathways+by+microRNAs.">Control of cell proliferation pathways by microRNAs.</a> Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).</li><li>Friedman, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92 (2009).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-281 (2004).</li><li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+microRNA+dysregulation+in+cancer.">Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 704 (2009).</li><li>Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+prostate+cancer.">MicroRNAs and prostate cancer.</a> Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).</li><li>Gordanpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-221+Is+down-regulated+in+TMPRSS2:ERG+fusion-positive+prostate+cancer.">miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer.</a> Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).</li><li>Nam, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+TMPRSS2:ERG+fusion+gene+predicts+cancer+recurrence+after+surgery+for+localised+prostate+cancer.">Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer.</a> Br. J. Cancer. 97, 1690 (2007).</li><li>Ambs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer.">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68, 6162 (2008).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-34a+inhibits+prostate+cancer+stem+cells+and+metastasis+by+directly+repressing+CD44.">The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44.</a> Nat. Med. 17, 211 (2011).</li></ol>

Avvikande uttryck av vissa miRNA har genomgående visat i prostatatumörer jämfört med normal vävnad 10, och några av dessa miRNA har angivits såsom möjliga nya terapeutiska medel mot prostatacancer 11. Därigenom de avvikande expressionsnivåer av miRNA kan vara användbara diagnostiska och / eller prognostisk biomarkörer. Real-Time qPCR metodik presenteras här ger en analys för exakt kvantifiering av miRNA nivåer i prostata tumörvävnad. Den miScript PCR-system användes kan detektera ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Trizol-reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 15.596 </td></tr><tr><td> miScript omvänd transkription Kit </td><td> Qiagen </td><td> 218.061 </td></tr><tr><td> miScript Primer Analyser </td><td> Qiagen </td><td> Experimentet specifik </td></tr><tr><td> miScript SYBR Green PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 218.073 </td></tr><tr><td> LightCycler 3,5 Real-Time PCR System </td><td> Roche </td><td></td></tr><tr><td> Ljus Cycler Kapillärer </td><td> Roche </td><td> 04929292001 </td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 spektrofotometer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 2538 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> G2943CA </td><td></td></tr></tbody></table>

microrna detection in prostate tumors by quantitative real-time pcr (qpcr)

MikroRNA (miRNA) är enkelsträngade, 18-24 nukleotider lång, icke-kodande RNA-molekyler. De är involverade i praktiskt taget varje cellulär process med utveckling 1, apoptos 2 och cellcykelreglering 3. MiRNA beräknas för att reglera uttrycket av 30% till 90% av humana gener 4 genom bindning till sina mål-RNA budbärar (mRNA) 5. Utbredd dysreglering av miRNA har rapporterats i olika sjukdomar och subtyper cancer 6. På grund av deras förekomst och unika struktur, dessa små molekyler är sannolikt att bli nästa generation av biomarkörer, terapeutiska medel och / eller mål. Metoder som används för att undersöka miRNA uttrycket inkluderar SYBR Green I färgpulverbaserat samt Taqman-prob baserad qPCR. Om miRNA ska användas effektivt i klinisk miljö, är det absolut nödvändigt att deras upptäckt i färsk och / eller arkiveras kliniska prover vara korrekt, reproducerbar, och SPecific. qPCR har använts i stor omfattning för att validera expression av miRNA i hela genom analyser såsom microarray studier 7. De prover som användes i detta protokoll var från patienter som genomgick radikal prostatektomi för kliniskt lokaliserad prostatacancer, men andra vävnader och cellinjer kan vara substituerad i. Prostata prover snabbfrystes i flytande kväve efter resektion. Kliniska variabler och uppföljning information för varje patient togs in för senare analys 8. Kvantifiering av miRNA nivåer i prostatatumör prover. De viktigaste stegen i qPCR analys av tumörer är: Total RNA-extraktion, cDNA-syntes, och detektion av qPCR produkter med användning av miRNA-specifika primrar. Total-RNA, som innefattar mRNA miRNA, och andra små RNA extraherades från prover med användning av TRIzol-reagens. Qiagen har miScript system användes för att syntetisera cDNA och utföra qPCR (figur 1). Endogena miRNA inte polyadenylated därför under den omvända transkriptionen, polyadenylates en poly (A)-polymeras i miRNA. Den miRNA används som en mall för att syntetisera cDNA med användning av oligo-dT och omvänt transkriptas. En universell tagg-sekvensen på 5&#39;-änden av oligo-dT-primrar underlättar amplifieringen av cDNA i PCR-steget. PCR-produkten amplifiering detekteras genom nivån av fluorescens som emitteras av SYBR Green, ett färgämne som interkalerar till dubbelsträngat DNA. Specifika miRNA primers, tillsammans med en universell primer som binder till den universella taggen sekvensen kommer att förstärka specifika miRNA sekvenser. De miScript Primer Analyser finns i över tusen mänskligt specifika miRNA och hundratals murina-specifika miRNA. Relativ kvantifiering metod användes här för att kvantifiera uttrycket av miRNA. För att korrigera för variationer mellan olika prover, är expressionsnivåer av en mål-miRNA normaliserades till de expressionsnivåer av en referens-genen. Valet av en GEne som att normalisera uttrycket av mål är kritisk i relativ kvantifiering analysmetod. Exempel på referens gener som vanligtvis används i denna egenskap är den lilla RNA RNU6B, RNU44 och RNU48 eftersom de anses vara stabilt uttryckas i de flesta prover. I detta protokoll är RNU6B används som referens-genen.

Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR at JoVE.com

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Kvantitativ realtids-polymeras-kedjereaktion (qPCR) är en snabb och känslig metod för att undersöka expressionsnivåema av olika mikro-RNA (miRNA) molekyler i tumörprover. Med användning av denna metod uttryck av hundratals olika miRNA molekyler kan amplifieras, kvantifieras, och analyserades från samma cDNA-mall.

MikroRNA Detektion av prostatatumörer genom kvantitativ realtids-PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Research

JoVE Journal

Medicine

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

Multispektrala realtid Fluorescens Imaging för intraoperativ Identifiering av Sentinel Lymph nod i gynekologisk onkologi

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical ...

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

En realtid Elektrisk Impedans Baserat teknik för att mäta Invasion av Endotelcell Monolayer av cancerceller

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Utvärdering av nanopartiklar Upptag i tumörer i realtid med hjälp Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Upptäckt och Genogrouping av norovirus från Barnens Pallar Genom Taqman Ett steg RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Heterogenitet Kartläggning av Protein Expression i tumörer med hjälp av kvantitativa Immunofluorescens

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identifiering av<em&gt; Törnrosa</em&gt; Transposoninsättningar i solida tumörer med Linker-medierad PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Rörelse Omskolning med feedback i realtid för prestanda

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Använda kvantitativ realtids-PCR för att avgöra Engraftment donatorcellen i en konkurrenskraftig Murine Bone Marrow Transplantation Modell

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Cerebrospinalvätska MikroRNA Profilering Med kvantitativa realtid-PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

Realtids cytotoxicitetsanalyser i humant helblod

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...