Name: harvesting murine alveolar macrophages and evaluating cellular activation induced by polyanhydride nanoparticles
Uploaded: 2012-06-08T12:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier le US Army Medical Research et du matériel de commande (Numéros de subvention W81XWH-09-1-0386 et W81XWH-10-1-0806) pour un soutien financier et le Dr Shawn Rigby de la Facilité Iowa State University cytométrie en flux pour son assistance technique spécialisée.

1. La récolte macrophages alvéolaires (AMɸ) à partir de la souris en utilisant lavage du poumon <ol><li> Porter un équipement de protection individuelle (EPI) comme un sarrau de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection. </li><li> Préparer complète AMɸ (cAMɸ) moyenne avant le début de la récolte. Ajouter 2,5 mL de pénicilline / streptomycine (pénicilline / streptomycine) solution, 250 pi de β-mercaptoéthanol (2-mercaptoéthanol), et 25 ml de la chaleur sérum inactivé de veau fœtal...

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	<li>Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+biomaterials.">Immunomodulatory biomaterials.</a> Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).</li><li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms.">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li><li>Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polymer+chemistry+and+fabrication+method+on+protein+release+and+stability+from+polyanhydride+microspheres.">Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).</li><li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release.">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li><li>Ulery, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+Protective+Single-Dose+Intranasal+Nanoparticle-Based+Vaccine+Platform+for+Respiratory+Infectious+Diseases.">Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases.</a> PLoS ONE. 6, e17642 (2011).</li><li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells.">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li><li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants.">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li><li>Torres, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyanhydride+microparticles+enhance+dendritic+cell+antigen+presentation+and+activation.">Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation.</a> Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).</li><li>Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+transport+pathogens+to+lung+draining+lymph+nodes.">Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes.</a> J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).</li><li>Barletta, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+compartments+in+the+mouse+lung:+Distinguishing+between+marginated,+interstitial,+and+alveolar+cells+in+response+to+injury.">Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury.</a> J. Immunol. Methods. , (2011).</li><li>Rubins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages:+wielding+the+double-edged+sword+of+inflammation.">Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).</li><li>Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Murine+Genetic+Predisposition+to+Pneumococcal+Infection+Reveals+a+Critical+Role+of+Alveolar+Macrophages+in+Maintaining+the+Sterility+of+the+Lower+Respiratory+Tract.">Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract.</a> Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).</li><li>Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+Macrophages+that+Phagocytose+Apoptotic+Neutrophils+Produce+Hepatocyte+Growth+Factor+during+Bacterial+Pneumonia+in+Mice.">Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).</li><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+macrophage+heterogeneity.">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li><li>Ulery, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres.">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li><li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles.">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li><li>Irvin, C. G., Bates, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+lung+function+in+the+mouse:+the+challenge+of+size.">Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size.</a> Respir. Res. 4, 4 (2003).</li></ol>

Plates-formes de nanoparticules polyanhydride vaccins ont montré une efficacité lorsqu&#39;il est administré par voie intranasale à des posologies à dose unique 5. Mesure de l&#39;activation des cellules phagocytaires populations résidentes dans les poumons induites par cette plate-forme d&#39;administration des vaccins permettant l&#39;évaluation de sa capacité potentielle à terme, de promouvoir des réponses immunitaires adaptatives. Plus précisément, la récolte des ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> CAM médias </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> 50 mM de 2-mercaptoéthanol </td><td> Sigma </td><td> M3148-25ML </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine 10000 ug / ml Solution </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> FACS tampon </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de potassium </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td> Le phosphate de potassium </td><td> Fisher Scientific </td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (Bovine Serum Albumin) </td><td> Sigma </td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;azoture de sodium </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat IgG </td><td> Sigma </td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mme CD16/32 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mme CMH II haplotype IA / IE, clone M5/114.15.2, conjugué à l&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC) </td><td> EBIOScience </td><td> 11-5321 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD86, clone GL-1, conjugué à l&#39;allophycocyanine (APC)-Cy7 </td><td> Biolegend </td><td> 105030 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD40, clone 1C10, conjugué à l&#39;APC </td><td> eBioscience </td><td> 17-0401 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD209, clone 5h10, conjugués à la biotine </td><td> eBioscience </td><td> 13-2091 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD11b, clone M1/70, conjugué à Alexa Fluor 700 </td><td> eBioscience </td><td> 56-0112 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris F4/80, clone BM8, conjugué à la phycoérythrine (PE)-Cy7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-rouge Texas streptavidine conjuguée </td><td> BD Biosciences </td><td> 551487 </td><td></td></tr><tr><td> Autres fournitures et réactifs </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éthanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A405-20 </td><td> Utilisé comme 70% (v / v) </td></tr><tr><td> Comprimé CO 2 </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 1 ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Souverain 3 ½ &quot;Père Tom Catcatheter </td><td> Kendall </td><td> 703021 </td><td></td></tr><tr><td> Prévention des risques biotechnologiques du Cabinet </td><td> NuAire </td><td> Série 22 </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux de dissection </td><td> Pêcheur </td><td> 138082 </td><td></td></tr><tr><td> Forceps </td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 1X, sans calcium et de magnésium </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> 15 Tubes à centrifuger mL avec bouchon à vis </td><td> VWR International </td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue Culture Six-bien traités Plaques </td><td> Costar </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Portoirs pour tubes en plastique </td><td> Nalgene </td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td> Grattoir à cellules 24 cm </td><td> PPT </td><td> 99002 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml en polystyrène à fond rond Tube </td><td> Faucon </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet-Aid XL </td><td> Drummond </td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10, 5, et 2 mL Pipettes </td><td> Pêcheur </td><td> 13-675 </td><td></td></tr><tr><td> 200 et 10 ul micropipettes </td><td> Gilson Pipetman </td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200 et 10 embouts de pipette ul </td><td> Pêcheur </td><td> 02-707 </td><td></td></tr><tr><td> BD stabilisationFixateur </td><td> BD Biosciences </td><td> 338036 </td><td></td></tr><tr><td> Isoton II Diluant </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 8546719 </td><td></td></tr><tr><td> Zap-oglobin II lytique réactif </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 7546138 </td><td></td></tr><tr><td> Flacons Coulter polystyrène compteur </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes à essai </td><td> BD Biosciences </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Équipement </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse réfrigérée </td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td> Incubateur humidifié CO 2 </td><td> Nuaire </td><td> Autoflow Modèle 8500 </td><td></td></tr><tr><td> Cytomètre en flux FACSCanto </td><td> BD Biosciences </td><td> 338960 </td><td></td></tr><tr><td> Compteur de particules Coulter Z1 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td> Équipement de traitement Sonicator liquide avec Microtip </td><td> Misonix </td><td> Modèle n ° S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

harvesting murine alveolar macrophages and evaluating cellular activation induced by polyanhydride nanoparticles

Nanoparticules biodégradables ont émergé comme une plate-forme polyvalente pour la conception et la mise en œuvre de nouveaux vaccins par voie intranasale contre les maladies respiratoires infectieuses. En particulier, polyanhydride nanoparticules composé de l&#39;acide sébacique aliphatique (SA), l&#39;aromatique 1,6-bis (p-carboxyphénoxy) hexane (CPH), ou l&#39;amphiphile 1,8-bis (p-carboxyphénoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) afficher en vrac unique et cinétique d&#39;érosion de surface 1,2 et peut être exploitée afin de libérer lentement biomolécules fonctionnelles (par exemple, les antigènes protéiques, des immunoglobulines, etc) in vivo 3,4,5. Ces nanoparticules possèdent également une activité adjuvante intrinsèque, ce qui les rend un excellent choix pour une plate-forme d&#39;administration des vaccins 6,7,8. Afin d&#39;élucider les mécanismes qui régissent l&#39;activation de l&#39;immunité innée après la vaccination muqueuse nasale, il faut évaluer les réponses moléculaires et cellulaires de la p antigènecellules sentant (APC) responsables pour initier des réponses immunitaires. Les cellules dendritiques sont des APC principaux trouvés dans des voies aériennes, tandis que les macrophages alvéolaires (AMɸ) prédominent dans le parenchyme pulmonaire 9,10,11. AMɸ sont très efficaces dans l&#39;élimination des poumons de pathogènes microbiens et 12,13 débris cellulaires. En outre, ce type de cellule joue un rôle important dans le transport d&#39;antigènes microbiens vers les ganglions lymphatiques drainant, ce qui est une première étape importante dans l&#39;initiation d&#39;une réponse immunitaire adaptative 9. AMɸ également exprimer des niveaux élevés de reconnaissance de formes innée et récepteurs éboueurs, sécrètent des médiateurs pro-inflammatoires, et les lymphocytes T 12,14. Une population relativement pure de AMɸ (par exemple, supérieure à 80%) peut être facilement obtenu par un lavage du poumon à l&#39;étude dans le laboratoire. Resident AMɸ récoltées à partir de immunitaires des animaux compétentes de fournir un phénotype représentant des macrophages qui encounter le vaccin à base de particules in vivo. Ici, nous décrivons les protocoles utilisés pour la récolte et la culture AMɸ de souris et d&#39;examiner le phénotype d&#39;activation des macrophages après le traitement avec des nanoparticules polyanhydride in vitro.

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Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Ici, nous décrivons les protocoles pour la récolte des macrophages alvéolaires murins, qui sont des résidents cellules immunitaires innées dans le poumon, et en examinant leur activation en réponse à la co-culture avec des nanoparticules polyanhydride.

La récolte macrophages alvéolaires murins et l&#39;évaluation d&#39;activation cellulaire induite par des nanoparticules polyanhydride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Analyser l&#39;internalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries multi-spectrale par cytométrie de flux d&#39;imagerie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Recherche

Bio-ingénierie

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

À haut débit la synthèse des glucides et fonctionnalisation de nanoparticules polyanhydride

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d&#39;analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Microbiologiquement Induced Précipitation de calcite Mediated par<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

Identification des nanoparticules d&#39;oxyde de métal dans des échantillons histologiques par cartographie Darkfield Microscopie et hyperspectrale Enhanced

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Production de nanoparticules métalliques par laser-ablation pulsée dans les liquides: un outil pour étudier les propriétés antibactériennes des nanoparticules

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Fonctionnalisation de surface des nanoparticules de Virus de l’hépatite E à l’aide de méthodes chimiques de conjugaison

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Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Réprimer la Transcription du gène en redirigeant la machinerie cellulaire avec des modificateurs chimiques épigénétiques

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