Name: harvesting murine alveolar macrophages and evaluating cellular activation induced by polyanhydride nanoparticles
Uploaded: 2012-06-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles at JoVE.com

Författarna vill tacka den amerikanska armén medicinsk forskning och Materielverk (Grant Numbers W81XWH-09-1-0386 och W81XWH-10-1-0806) för finansiellt stöd och Dr Shawn Rigby från Iowa State University flödescytometri Anläggning för hans sakkunnig tekniskt bistånd.

1. Skördning alveolära makrofager (AMɸ) från mus med användning av lungsköljning <ol><li> Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE), såsom en labbrock, engångshandskar och korrekt ögonskydd. </li><li> Förbered komplett AMɸ (cAMɸ) medium innan initiering av skörd. Tillsätt 2,5 ml av penicillin / streptomycin (pen / strep)-lösning, 250 | il av β-merkaptoetanol (2-merkaptoetanol) och 25 ml värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) till 222,25 ml Dulbelcco s Modified Eagle Medium (DMEM). Filterst...

<ol>
	<li>Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+biomaterials.">Immunomodulatory biomaterials.</a> Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).</li><li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms.">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li><li>Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polymer+chemistry+and+fabrication+method+on+protein+release+and+stability+from+polyanhydride+microspheres.">Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).</li><li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release.">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li><li>Ulery, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+Protective+Single-Dose+Intranasal+Nanoparticle-Based+Vaccine+Platform+for+Respiratory+Infectious+Diseases.">Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases.</a> PLoS ONE. 6, e17642 (2011).</li><li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells.">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li><li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants.">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li><li>Torres, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyanhydride+microparticles+enhance+dendritic+cell+antigen+presentation+and+activation.">Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation.</a> Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).</li><li>Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+transport+pathogens+to+lung+draining+lymph+nodes.">Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes.</a> J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).</li><li>Barletta, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+compartments+in+the+mouse+lung:+Distinguishing+between+marginated,+interstitial,+and+alveolar+cells+in+response+to+injury.">Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury.</a> J. Immunol. Methods. , (2011).</li><li>Rubins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages:+wielding+the+double-edged+sword+of+inflammation.">Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).</li><li>Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Murine+Genetic+Predisposition+to+Pneumococcal+Infection+Reveals+a+Critical+Role+of+Alveolar+Macrophages+in+Maintaining+the+Sterility+of+the+Lower+Respiratory+Tract.">Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract.</a> Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).</li><li>Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+Macrophages+that+Phagocytose+Apoptotic+Neutrophils+Produce+Hepatocyte+Growth+Factor+during+Bacterial+Pneumonia+in+Mice.">Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).</li><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+macrophage+heterogeneity.">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li><li>Ulery, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres.">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li><li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles.">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li><li>Irvin, C. G., Bates, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+lung+function+in+the+mouse:+the+challenge+of+size.">Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size.</a> Respir. Res. 4, 4 (2003).</li></ol>

Polyanhydrid nanopartiklar vaccin plattformar har visat effekt när det ges intranasalt i enkel dos regimer 5. Mätning av aktivering av inhemska fagocytiska cellpopulationerna i lungorna orsakade av detta vaccin plattform medger utvärdering av dess potential förmåga att slutligen främja adaptiva immunsvar. Specifikt skörd alveolära makrofager från lungsköljning vätska och behandla dem med olika formuleringar av nanopartiklar ger insikter i förmåga olika partikel kemier...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> CAM Media </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> 50 mM 2-merkaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M3148-25 ml </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin 10000 pg / ml lösning </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-Cl </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt bovint serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> FACS-buffert </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Natriumklorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumfosfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumklorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumfosfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (bovint serumalbumin) </td><td> Sigma </td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> Antikroppar </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rått-IgG </td><td> Sigma </td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ms CD16/32 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ms-MHC-haplotypen II lA / IE, klon M5/114.15.2, konjugerad till fluorescein isotiocyanat (FITC) </td><td> eBioscience </td><td> 11-5321 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mus-CD86, klon GL-1, konjugerad med allofykocyanin (APC)-Cy7 </td><td> Biolegend </td><td> 105.030 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mus-CD40, klon 1C10, konjugerad till APC </td><td> eBioscience </td><td> 17-0401 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mus-CD209, klon 5H10, konjugerade till biotin </td><td> eBioscience </td><td> 13-2091 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mus CD11b, klon M1/70, konjugerad till Alexa Fluor 700 </td><td> eBioscience </td><td> 56-0112 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mus F4/80, klon BM8, konjugerad till fykoerytrin (PE)-Cy7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Texas röd konjugerad streptavidin </td><td> BD Biosciences </td><td> 551.487 </td><td></td></tr><tr><td> Tillbehör och reagenser </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A405-20 </td><td> Användas som 70% (volym / volym) </td></tr><tr><td> Komprimerad CO 2 </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml spruta </td><td> BD Biosciences </td><td> 309.659 </td><td></td></tr><tr><td> Sovereign 3 ½ &quot;Fr Tom Catcatheter </td><td> Kendall </td><td> 703.021 </td><td></td></tr><tr><td> Biosäkerhet Skåp </td><td> NUAIRE </td><td> Serie 22 </td><td></td></tr><tr><td> Dissekering Saxar </td><td> Fisher </td><td> 138.082 </td><td></td></tr><tr><td> Tång </td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 1X utan kalcium och magnesium </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml centrifugrör med skruvlock </td><td> VWR International </td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td> Sex-brunnars vävnadsodlingsbehandlade Plattor </td><td> Costar </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Plast Tube Racks </td><td> Nalgene </td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td> Cellskrapa 24 cm </td><td> TPP </td><td> 99.002 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml Polystyren rundbottnad Tube </td><td> Falcon </td><td> 352.008 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettera-stöd XL </td><td> Drummond </td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10, 5, och 2 ml pipetter </td><td> Fisher </td><td> 13-675 </td><td></td></tr><tr><td> 200 och 10 | il micropipettors </td><td> Gilson Pipetman </td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200 och 10 mikroliter pipettspetsar </td><td> Fisher </td><td> 02-707 </td><td></td></tr><tr><td> BD StabiliserandeFixativ </td><td> BD Biosciences </td><td> 338.036 </td><td></td></tr><tr><td> Isoton II Spädningsmedel </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 8546719 </td><td></td></tr><tr><td> Zap-oglobin II lyseringsreagens </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 7546138 </td><td></td></tr><tr><td> Coulter Counter polystyren Injektionsflaskor </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td> Provrör </td><td> BD Biosciences </td><td> 352.008 </td><td></td></tr><tr><td> Utrustning </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kylcentrifug </td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td> Fuktad inkubator CO 2 </td><td> Nuaire </td><td> Modell Autoflöde 8500 </td><td></td></tr><tr><td> FACSCanto flödescytometer </td><td> BD Biosciences </td><td> 338.960 </td><td></td></tr><tr><td> Coulter Particle Counter Z1 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td> Sonicator Flytande Bearbetning Utrustning mikrospets </td><td> Misonix </td><td> Modell nr S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

harvesting murine alveolar macrophages and evaluating cellular activation induced by polyanhydride nanoparticles

Biologiskt nedbrytbara nanopartiklar har visat sig vara en mångsidig plattform för utformning och genomförande av nya intranasala vaccin mot luftvägssjukdomar smittsamma sjukdomar. Specifikt nanopartiklar polyanhydrid sammansatt av den alifatiska sebacinsyra (SA), den aromatiska 1,6-bis (p-karboxifenoxi) hexan (CPH) eller den amfifila 1,8-bis (p-karboxifenoxi) -3,6-dioxaoktan (CPTEG) visa unika bulk och yta kinetik erosion 1,2 och kan utnyttjas för att långsamt släppa funktionella biomolekyler (t.ex. proteinantigener, immunglobuliner, etc.) in vivo 3,4,5. Dessa nanopartiklar också ha inneboende adjuvant aktivitet, vilket gör dem ett utmärkt val för ett vaccin plattform 6,7,8. För att belysa de mekanismer som styr aktiveringen av medfödda immuniteten efter intranasal slemhinnor vaccination måste man utvärdera de molekylära och cellulära svar från antigenet pterar celler (APC) som är ansvariga för initiering immunsvar. Dendritiska celler är de viktigaste APC som finns i luftvägarna, medan alveolära makrofager (AMɸ) dominerar i lungparenkym 9,10,11. AMɸ är mycket effektiva i att rensa lungorna hos mikrobiella patogener och cellrester 12,13. Dessutom spelar denna celltyp en värdefull roll i transporten av mikrobiella antigener till dränerande lymfkörtlar, vilket är ett viktigt första steg i initieringen av ett adaptivt immunsvar 9. AMɸ också uttrycka förhöjda halter av medfödda mönsterigenkänning och receptorer asätare, utsöndrar proinflammatoriska mediatorer och prime naiva T-celler 12,14. En relativt ren population av AMɸ (t.ex. större än 80%) kan lätt erhållas genom lungsköljning för undersökning i laboratoriet. Hemvist AMɸ skördas från immunkompetenta djur tillhandahålla en representativ fenotypen av makrofager som kommer encounter partikel-baserat vaccin in vivo. Häri beskriver vi de protokoll som används för att skörda och kultur AMɸ från möss och undersöka aktiveringen fenotypen av makrofager efter behandling med polyanhydrid nanopartiklar in vitro.

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles at JoVE.com

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Häri beskriver vi protokoll för skörd murina alveolära makrofager, som är bosatta medfödda immunceller i lungan, och undersöka deras aktivering som svar på samodling med polyanhydrid nanopartiklar.

Skörd Murina alveolära makrofager och utvärdera cellulär aktivering inducerad av polyanhydrid Nanopartiklar

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Analysera Cellulär internalisering av Nanopartiklar och bakterier genom att multispektralt Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Hög kapacitet Syntes av kolhydrater och Funktionalisering av polyanhydrid Nanopartiklar

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Utvärdering av polymera Gene Delivery nanopartiklar genom nanopartikel Tracking Analys och hög kapacitet flödescytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Använda Cell-substrat Impedans och levande cell imaging att mäta Realtids Förändringar i Cellular Adhesion och De-vidhäftning inducerad av Matrix Ändring

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Mikrobiologiskt inducerad Calcite Nederbörd medierad av<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

Identifiering av Metal Oxide Nanopartiklar i histologiska prov av Enhanced Darkfield mikroskopi och Hyperspektrala Mapping

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Produktion av metall nanopartiklar genom pulserad laserablation i vätskor: Ett verktyg för att studera de antibakteriella egenskaperna hos nanopartiklar

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Ytan funktionalisering av hepatit E Virus nanopartiklar med kemiska konjugation metoder

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Ompressning gentranskription genom att omdirigera cellulära maskineriet med kemiska epigenetiska modifierare

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...