Name: analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2012-06-08T13:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare il ONR-MURI Award (NN00014-06-1-1176) e l&#39;US Army Medical Research e Materiel Command (numeri di sovvenzione W81XWH-09-1-0386 e W81XWH-10-1-0806) per finanziarie sostenere.

1. RAW 264,7 Colture Cellulari <ol><li> Harvest RAW 264.7 cellule dai loro fiaschi quando raggiungano la confluenza raschiando delicatamente con una spatola delle cellule. Conte e la piastra in un 24-ben piatto di coltura delle cellule ad una densità di 5 x 10 5 cellule / pozzetto in 0,5 mL completa Medio Dulbeccòs Modified Eagle (cDMEM; 10% inattivato al calore siero fetale bovino (FBS), 2 mM Glutamax, e HEPES 10 mM) e incubare durante la notte a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. </li></ol><p cla...

<ol>
	<li>Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+protective+single-dose+intranasal+nanoparticle-based+vaccine+platform+for+respiratory+infectious+diseases.">Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases.</a> PLoS One. 6, e17642 (2011).</li><li>Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., Garc&#237;a-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+the+magnitude+and+persistence+of+antibody+responses+with+innate+immunity.">Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.</a> Nature. 470, 543-547 (2011).</li><li>Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+particles+in+vaccine+delivery.">Polymeric particles in vaccine delivery.</a> Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).</li><li>Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyanhydrides+as+localized+drug+delivery+carrier:+an+update.">Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update.</a> Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).</li><li>Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino+ester)+micro-+and+nanospheres:+DNA+encapsulation+and+cellular+transfection.">Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection.</a> Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).</li><li>Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+matter:+quantitative+and+dynamic+analysis+of+the+formation+of+an+immunological+synapse+using+imaging+flow+cytometry.">Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).</li><li>Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+phagocytosis+and+bacterial+killing+by+human+neutrophils.">Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils.</a> J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).</li><li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+differentially+modulates+particle+binding,+phagocytosis+and+downstream+antimicrobial+mechanisms.">Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms.</a> Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).</li><li>Murphy, K. C., Campellone, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambda+Red-mediated+recombinogenic+engineering+of+enterohemorrhagic+and+enteropathogenic+E.+coli.">Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli.</a> BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).</li><li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria.">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57, 286-295 (2007).</li><li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres.">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li><li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+endocytosis.">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).</li><li>Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers:+optimization+and+pitfalls.">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li><li>Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-sensitive+non-phospholipid+vesicle+and+macrophage-like+cells:+binding,+uptake+and+endocytotic+pathway.">pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).</li><li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms.">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li></ol>

Studi hanno dimostrato che le nanoparticelle biodegradabili a base di poli (lattico-co-glicolico (PLGA) o polianidridi possono essere usati per fornire antigeni incapsulati o farmaci alle cellule bersaglio. Assorbimento di tali nanoparticelle di cellule fagocitiche è importante per la loro efficacia, rendendo quantitativa . analisi di interiorizzazione critica nella progettazione di nuovi sistemi di consegna delle nanoparticelle Utilizzando questo metodo, assorbimento differenziale di nanoparticelle di vari tipi di cel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> RAW 264,7 linea cellulare </td><td> Type Culture Collection (ATCC) </td><td> TIB-71 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccòs Modified Eaglès Medium (DMEM) </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S 11150 </td><td> Premium Grade </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Piastra da 24 pozzetti</td><td> TPP </td><td> 92024 </td><td></td></tr><tr><td> Coltura cellulare Boccette </td><td> TPP </td><td> 90151 </td><td></td></tr><tr><td> Cella scraper </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td> 24 cm </td></tr><tr><td> Salmonella enterica sierotipo Typhimurium </td><td> ATCC </td><td> 14028 </td><td></td></tr><tr><td> BTX ECM630 Manipolatore cella Electro </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP308 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione salina tamponata (PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ultrasuoni processore liquido </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Citocalasina D- </td><td> Sigma-Aldrich, </td><td> C8273 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldeide </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td><td></td></tr><tr><td> Tampone di lavaggio </td><td> 2% di FBS inattivato, sodio azide allo 0,1% in PBS. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Perm / tampone di lavaggio </td><td> BD Biosciences </td><td> 554714 </td><td></td></tr><tr><td> Clear-visualizzare microprovette tappo a scatto </td><td> Sigma </td><td> T4816 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 660 phalloidin </td><td> Invitrogen </td><td> A22285 </td><td></td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis Corporazione </td><td> 100200 </td><td> Opzioni: 658nm laser, autocampionatore </td></tr><tr><td> Sodio azide </td><td> Fisher Scientific </td><td> S 227I-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry

Sistemi di nanoparticelle sono emersi come strumenti preziosi nella consegna vaccino attraverso la loro capacità di fornire in modo efficiente merci, ivi compresi le proteine, le cellule presentanti l&#39;antigene 1-5. Internalizzazione di nanoparticelle (NP) da cellule presentanti l&#39;antigene è un punto critico nel generare una risposta immunitaria all&#39;antigene incapsulato. Per determinare come le alterazioni della funzionalità impatto formulazione di nanoparticelle, abbiamo cercato di sviluppare un elevato throughput, il protocollo sperimentale quantitativa che fosse compatibile con rilevare le nanoparticelle internalizzate così come batteri. Ad oggi, due tecniche indipendenti, microscopia e citometria di flusso, sono stati i metodi utilizzati per studiare la fagocitosi di nanoparticelle. La natura throughput elevato della citometria a flusso genera solidi dati statistici. Tuttavia, a causa della bassa risoluzione, non riesce a quantificare con precisione internalizzati contro cellule nanoparticelle associati. Microscopia genera immagini ad alta risoluzione spaziale; hazione sul mercato, è in termini di tempo e coinvolge campioni di piccole dimensioni 6-8. Multi-spettrale citometria a flusso di immagini (MIFC) è una nuova tecnologia che incorpora aspetti di microscopia e di citometria a flusso che esegue multi-color immagini spettrali di campo fluorescenza e luminoso simultaneamente attraverso un nucleo laminare. Questa funzionalità fornisce un&#39;analisi accurata di intensità di segnale fluorescenti e le relazioni spaziali tra le diverse strutture e funzioni cellulari ad alta velocità. Qui, descriviamo un metodo che utilizza MIFC per caratterizzare le popolazioni di cellule che hanno interiorizzato nanoparticelle polianidride o Salmonella enterica sierotipo Typhimurium. Si descrivono anche la preparazione di sospensioni di nanoparticelle, etichettatura cellulare, su un sistema di acquisizione ImageStream X e l&#39;analisi dei dati utilizzando l&#39;applicazione IDEE. Abbiamo inoltre dimostrato l&#39;applicazione di una tecnica che può essere utilizzata per differenziare il p internalizzazioneathways per nanoparticelle e batteri utilizzando citocalasina-D come un inibitore di actina-mediata fagocitosi.

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Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

In questo articolo descriviamo un metodo che utilizza multi-spettrale di citometria a flusso di imaging per quantificare l&#39;interiorizzazione delle nanoparticelle polianidride o batteri da parte delle cellule RAW 264.7.

Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Raccolta murini macrofagi alveolari e Valutare l&#39;attivazione cellulare indotta da nanoparticelle polianidride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Ricerca

Bioingegneria

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Nanoparticelle virali per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Tumore

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Ampio campo di microscopia a fluorescenza e citometria di flusso Imaging fluorescente su un telefono cellulare

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Localizzazione e quantificazione relativa dei nanotubi di carbonio in cellule con immagini multispettrali Citometria a Flusso

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

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Rilevazione sensibile di Proteopathic Semina attività con FRET Citometria a flusso

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Forno a microonde-driven sintesi di ossido di ferro Nanoparticelle per il rilevamento rapido di aterosclerosi

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolamento delle cellule della ganglioma della retina primaria (RGC) mediante citometria a flusso

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Funzionalizzazione superficiale delle nanoparticelle di Virus di epatite E utilizzando metodi di coniugazione chimica

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

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Rilevamento del cancro ovarico utilizzando la citometria a flusso fotoacustico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...