Name: analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2012-06-08T13:00:00
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著者は金融のためにONR-MURI賞（NN00014-06-1から1176）、米国陸軍医学研究および資材コマンド（グラント番号W81XWH-09-1から0386までとW81XWH-10-1-0806）に感謝したいサポートされています。

1。 RAW 264.7細胞培養<ol><li>彼らはセルスクレイパーで軽くこすることでコンフルエントに達する彼らのフラスコから収穫RAW 264.7細胞。 0.5 mLの5×10 5細胞/ウェルの密度で24ウェル細胞培養皿にカウントし、プレート、それらを完全にダルベッコ改変イーグル培地（cDMEM、10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）、2mMのグルタミン、および10mM HEPES）、5％CO 2インキュベーターで37°Cで一晩...

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	<li>Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+protective+single-dose+intranasal+nanoparticle-based+vaccine+platform+for+respiratory+infectious+diseases.">Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases.</a> PLoS One. 6, e17642 (2011).</li><li>Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., Garc&#237;a-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+the+magnitude+and+persistence+of+antibody+responses+with+innate+immunity.">Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.</a> Nature. 470, 543-547 (2011).</li><li>Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+particles+in+vaccine+delivery.">Polymeric particles in vaccine delivery.</a> Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).</li><li>Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyanhydrides+as+localized+drug+delivery+carrier:+an+update.">Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update.</a> Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).</li><li>Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino+ester)+micro-+and+nanospheres:+DNA+encapsulation+and+cellular+transfection.">Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection.</a> Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).</li><li>Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+matter:+quantitative+and+dynamic+analysis+of+the+formation+of+an+immunological+synapse+using+imaging+flow+cytometry.">Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).</li><li>Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+phagocytosis+and+bacterial+killing+by+human+neutrophils.">Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils.</a> J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).</li><li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+differentially+modulates+particle+binding,+phagocytosis+and+downstream+antimicrobial+mechanisms.">Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms.</a> Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).</li><li>Murphy, K. C., Campellone, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambda+Red-mediated+recombinogenic+engineering+of+enterohemorrhagic+and+enteropathogenic+E.+coli.">Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli.</a> BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).</li><li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria.">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57, 286-295 (2007).</li><li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres.">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li><li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+endocytosis.">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).</li><li>Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers:+optimization+and+pitfalls.">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li><li>Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-sensitive+non-phospholipid+vesicle+and+macrophage-like+cells:+binding,+uptake+and+endocytotic+pathway.">pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).</li><li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms.">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li></ol>

研究では、ポリ（乳酸 - コ - グリコール酸（PLGA）または無水物に基づく生分解性ナノ粒子は標的細胞にカプセル化された抗原または薬を届けるために使用することができることが示されている。貪食細胞によるこれらのナノ粒子の取り込みはこのように定量的な作成、その有効性のために重要である。小説ナノ粒子デリバリーシステムを設計する上で重要な内在化の分析は、このメソッドを...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> RAW 264.7細胞株</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC） </td><td> TIB-71 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td> Cellgro </td><td> 10から013-CV </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S 11150 </td><td>プレミアムグレード</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>ギブコ</td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td>ギブコ</td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td> TPP </td><td> 92024 </td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ</td><td> TPP </td><td> 90151 </td><td></td></tr><tr><td>セルスクレイパー</td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td> 24センチメートル</td></tr><tr><td> サルモネラ血清型Typhimuriumの</td><td> ATCC </td><td> 14028 </td><td></td></tr><tr><td> BTX ECM630エレクトロ細胞マニピュレータ</td><td> BTXハーバード装置</td><td></td><td></td></tr><tr><td> MOPS </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP308 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水（PBS） </td><td> Cellgro </td><td> 21から040-CV </td><td></td></tr><tr><td>超音波液体プロセッサ</td><td> MISONIX </td><td> S-4000 </td><td></td></tr><tr><td>サイトカラシンD </td><td> Sigma-Aldrich社、 </td><td> C8273 </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>ポリサイエン</td><td> 04018 </td><td></td></tr><tr><td>洗浄バッファーを</td><td> 2パーセント熱不活性化FBS、PBS中0.1％アジ化ナトリウム。 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>洗浄バッファーを/パーマ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 554714 </td><td></td></tr><tr><td>スナップキャップのマイクロチューブをクリア表示</td><td>シグマ</td><td> T4816 </td><td></td></tr><tr><td>のAlexa Fluor®ファロイジン660 </td><td>インビトロジェン</td><td> A22285 </td><td></td></tr><tr><td>のImageStream X </td><td> Amnisコーパスる</td><td> 100200 </td><td>オプション：658nmレーザー、オートサンプラ</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S 227I-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry

ナノシステムでは、抗原提示細胞へのタンパク質、1-5など、効率的に貨物を提供する能力を介してワクチンデリバリーの貴重なツールとして浮上している。抗原提示細胞によるナノ粒子の内在化（NP）がカプセル化された抗原に対する効果的な免疫応答を生成するための重要なステップです。ナノ粒子製剤の影響関数の中でどのように変更を決定するために、我々は内面化ナノ粒子と同様に細菌を検出すると互換性のある高スループット、定量的な実験的なプロトコルを開発しようとした。現在までに、2つの独立した技術、顕微鏡やフローサイトメトリーでは、ナノ粒子の食作用を研究するために使用されるメソッドでした。フローサイトメトリーのハイスループットな性質は堅牢な統計データを生成します。しかし、低解像度のために、それは正確にセル結合したナノ粒子の対内在化、定量化に失敗しました。顕微鏡は、高空間分解能で画像を生成します。However、それは時間がかかり、小さなサンプルサイズの6-8を伴います。マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー（MIFC）の層コアを介して同時にマルチカラースペクトルの蛍光と明視野イメージングを行う顕微鏡やフローサイトメトリーの両方の側面を組み込んだ新しいテクノロジです。この機能は、蛍光シグナル強度と異なる構造と高速で携帯電話の機能間の空間関係の正確な分析を提供します。 ここで、我々は、無水物ナノ粒子またはサルモネラ血清型Typhimuriumのを内面化した細胞集団を特徴づけるためにMIFCを利用する方法について説明します。我々はまた、ナノ粒子懸濁液、細胞標識、のImageStream Xシステム上で収集やアイデアのアプリケーションを使用してデータの分析の準備について説明します。また、インターナリpを区別するために使用することができる技術の応用を実証するアクチンを介した貪食の阻害剤としてサイトカラシンDを用いてナノ粒子と細菌のathways。

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Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

本稿では、RAW 264.7細胞による無水物ナノ粒子や細菌の内在化を定量化するためにマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを利用する方法について説明します。

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

のためのウイルス粒子<emインビボ&gt;</em&gt;腫瘍イメージング

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

携帯電話上の広視野蛍光顕微鏡と蛍光イメージングフローサイトメトリー

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

アテローム性動脈硬化症の高速検出のための酸化鉄ナノ粒子のマイクロ波駆動型の合成

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

光音響フローサイトメトリーを用いた卵巣癌検出

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...