Name: analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2012-06-08T13:00:00
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Os autores gostariam de agradecer o Prêmio ONR MURI-(NN00014-06-1-1176) e os EUA Army Medical Research e Material Command (Números Grant W81XWH-09-1-0386 e W81XWH-10-1-0806) para financeira apoiar.

1. Cultura de Células RAW 264,7 <ol><li> Colheita células RAW 264.7 de seus frascos quando atingem confluência raspando-as delicadamente com uma espátula de celulares. Contagem e da placa-los em um prato de cultura de 24 poços de células a uma densidade de 5 x 10 5 células / poço em 0,5 mL de Dulbecco Modificado completa Eagle Médium (cDMEM; 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de Glutamax, e 10 mM de HEPES) e incubar durante a noite a 37 ° C em um 5% de CO 2 incub...

<ol>
	<li>Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+protective+single-dose+intranasal+nanoparticle-based+vaccine+platform+for+respiratory+infectious+diseases.">Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases.</a> PLoS One. 6, e17642 (2011).</li><li>Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., Garc&#237;a-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+the+magnitude+and+persistence+of+antibody+responses+with+innate+immunity.">Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.</a> Nature. 470, 543-547 (2011).</li><li>Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+particles+in+vaccine+delivery.">Polymeric particles in vaccine delivery.</a> Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).</li><li>Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyanhydrides+as+localized+drug+delivery+carrier:+an+update.">Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update.</a> Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).</li><li>Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino+ester)+micro-+and+nanospheres:+DNA+encapsulation+and+cellular+transfection.">Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection.</a> Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).</li><li>Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+matter:+quantitative+and+dynamic+analysis+of+the+formation+of+an+immunological+synapse+using+imaging+flow+cytometry.">Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).</li><li>Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+phagocytosis+and+bacterial+killing+by+human+neutrophils.">Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils.</a> J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).</li><li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+differentially+modulates+particle+binding,+phagocytosis+and+downstream+antimicrobial+mechanisms.">Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms.</a> Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).</li><li>Murphy, K. C., Campellone, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambda+Red-mediated+recombinogenic+engineering+of+enterohemorrhagic+and+enteropathogenic+E.+coli.">Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli.</a> BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).</li><li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria.">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57, 286-295 (2007).</li><li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres.">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li><li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+endocytosis.">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).</li><li>Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers:+optimization+and+pitfalls.">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li><li>Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-sensitive+non-phospholipid+vesicle+and+macrophage-like+cells:+binding,+uptake+and+endocytotic+pathway.">pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).</li><li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms.">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li></ol>

Estudos têm demonstrado que as nanopartículas biodegradáveis ​​à base de poli (ácido láctico-co-glicólico (PLGA), ou polianidridos podem ser utilizados para entregar antigénios encapsulados ou drogas às células alvo. Uptake destas nanopartículas pelas células fagocíticas é importante para a sua eficácia, tornando assim quantitativa . análise de internalização crítico na concepção de novos sistemas de entrega de nanopartículas Ao utilizar este método, a absorção diferencial de nanopartículas...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Linha de células RAW 264,7 </td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> TIB-71 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S 11150 </td><td> Nível de equipamento Premium </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> 24-bem placa</td><td> TPP </td><td> 92024 </td><td></td></tr><tr><td> Frascos de cultura de células </td><td> TPP </td><td> 90151 </td><td></td></tr><tr><td> Raspador celular </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td> 24 cm </td></tr><tr><td> Salmonella enterica sorovar Typhimurium </td><td> ATCC </td><td> 14028 </td><td></td></tr><tr><td> BTX ECM630 Manipulator célula eletroquímica </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP308 </td><td></td></tr><tr><td> Salina tamponada com fosfato (PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Processador líquido ultra-sônica </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Citocalasina-D </td><td> Sigma-Aldrich, </td><td> C8273 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldeído </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td><td></td></tr><tr><td> O tampão de lavagem </td><td> 2% de FBS inactivado calor, azida de sódio a 0,1% em PBS. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Perm / tampão de lavagem </td><td> BD Biosciences </td><td> 554714 </td><td></td></tr><tr><td> Clear-visualizar microtubos tampa de encaixe </td><td> Sigma </td><td> T4816 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor faloidina 660 </td><td> Invitrogen </td><td> A22285 </td><td></td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis Corporação </td><td> 100200 </td><td> Opções: 658nm laser, amostrador automático </td></tr><tr><td> A azida de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S 227I-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry

Sistemas nanoparticulados surgiram como instrumentos valiosos na entrega de vacina através da sua capacidade para entregar eficientemente carga, incluindo proteínas, para as células apresentadoras de antigénio 1-5. Internalização de nanopartículas (NP) por células apresentadoras de antigénio é um passo crítico na geração de uma resposta imune eficaz para o antigénio encapsulado. Para determinar como as mudanças em função de nanopartículas impacto formulação, buscou-se desenvolver um alto throughput, protocolo quantitativo experimental que era compatível com a detecção de nanopartículas internalizadas, bem como bactérias. Até à data, duas técnicas independentes, microscopia e citometria de fluxo, têm sido os métodos utilizados para estudar a fagocitose de nanopartículas. A natureza de alto rendimento da citometria de fluxo gera robustos dados estatísticos. No entanto, devido à baixa resolução, ele não consegue quantificar com precisão internalizado contra células nanopartículas encadernados. Microscopia gera imagens com alta resolução espacial; however, é demorado e envolve amostras de pequenas dimensões 6-8. Multi-espectrais de citometria de fluxo de imagem (CFMI) é uma nova tecnologia, que incorpora os aspectos de microscopia e citometria de fluxo que executa várias cores de imagem de campo brilhante e fluorescência espectral simultaneamente através de um núcleo laminar. Este recurso fornece uma análise acurada da intensidade de sinal fluorescentes e as relações espaciais entre as diferentes estruturas e funções celulares em alta velocidade. Aqui, nós descrevemos um método utilizando CFMI para caracterizar as populações de células que têm internalizado nanopartículas polianidrido ou Salmonella enterica sorovar Typhimurium. Descrevemos também a preparação de suspensões de nanopartículas, de rotulagem celular, aquisição de um sistema X ImageStream e análise dos dados usando o aplicativo IDÉIAS. Nós também demonstrar a aplicação de uma técnica que pode ser utilizado para diferenciar o p internalizaçãoathways para as nanopartículas e bactérias por utilizando citocalasina-D como um inibidor da actina mediada por fagocitose.

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Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Neste artigo, nós descrevemos um método utilizando multi-espectral citometria de fluxo de imagem para quantificar a internalização de nanopartículas polianidrido ou bactérias por células RAW 264.7.

Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Bioengenharia

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Nanopartículas virais para<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Tumor

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Largo-campo microscopia de fluorescência e citometria de fluxo fluorescente de imagens em um telefone celular

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

Síntese orientada por microondas de óxido de ferro nanopartículas para detecção rápida de Aterosclerose

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Functionalization superfície de nanopartículas de vírus de hepatite E usando métodos de conjugação química

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Detecção de câncer de ovário usando citometria de fluxo fotoacústico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...