Name: analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2012-06-08T13:00:00
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Los autores desean agradecer el Premio ONR-Muri (NN00014-06-1-1176) y el Ejército de los EE.UU. de Investigación Médica y Material de comandos (números de concesión W81XWH-09-1-0386 y W81XWH-10-1-0806) de financiera apoyar.

1. RAW 264.7 de Cultivos Celulares <ol><li> Cosecha de células RAW 264.7 de sus frascos cuando llegan a la confluencia raspando suavemente con un raspador de células. Recuento y la placa de ellos en una placa celular de 24 pocillos de cultivo a una densidad de 5 x 10 5 células / pocillo en 0,5 ml completa Medio de Dulbecco Modificado de Eagle (cDMEM; 10% inactivado por calor suero bovino fetal (FBS), 2 mM de Glutamax, y HEPES 10 mM) e incubar durante una noche a 37 ° C en un 5% de CO 2 incuba...

<ol>
	<li>Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+protective+single-dose+intranasal+nanoparticle-based+vaccine+platform+for+respiratory+infectious+diseases.">Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases.</a> PLoS One. 6, e17642 (2011).</li><li>Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., Garc&#237;a-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+the+magnitude+and+persistence+of+antibody+responses+with+innate+immunity.">Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.</a> Nature. 470, 543-547 (2011).</li><li>Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+particles+in+vaccine+delivery.">Polymeric particles in vaccine delivery.</a> Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).</li><li>Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyanhydrides+as+localized+drug+delivery+carrier:+an+update.">Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update.</a> Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).</li><li>Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino+ester)+micro-+and+nanospheres:+DNA+encapsulation+and+cellular+transfection.">Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection.</a> Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).</li><li>Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+matter:+quantitative+and+dynamic+analysis+of+the+formation+of+an+immunological+synapse+using+imaging+flow+cytometry.">Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).</li><li>Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+phagocytosis+and+bacterial+killing+by+human+neutrophils.">Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils.</a> J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).</li><li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+differentially+modulates+particle+binding,+phagocytosis+and+downstream+antimicrobial+mechanisms.">Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms.</a> Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).</li><li>Murphy, K. C., Campellone, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambda+Red-mediated+recombinogenic+engineering+of+enterohemorrhagic+and+enteropathogenic+E.+coli.">Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli.</a> BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).</li><li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria.">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57, 286-295 (2007).</li><li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres.">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li><li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+endocytosis.">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).</li><li>Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers:+optimization+and+pitfalls.">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li><li>Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-sensitive+non-phospholipid+vesicle+and+macrophage-like+cells:+binding,+uptake+and+endocytotic+pathway.">pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).</li><li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms.">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li></ol>

Los estudios han demostrado que las nanopartículas biodegradables a base de poli (láctico-co-ácido glicólico (PLGA) o polianhídridos pueden ser utilizados para entregar antígenos encapsulados o fármacos a células diana. Captación de estas nanopartículas por las células fagocíticas es importante para su eficacia, haciendo así cuantitativo . análisis de la internalización crítico en el diseño de nuevos sistemas de entrega de nanopartículas Mediante este método, la absorción diferencial de nanopartícul...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> RAW 264.7 línea celular </td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> TIB-71 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco Eagle modificado (DMEM) </td><td> Cellgro </td><td> 10 a 013 CV </td><td></td></tr><tr><td> Suero bovino fetal </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S 11150 </td><td> Prima de Grado </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> 24-pocillos</td><td> TPP </td><td> 92024 </td><td></td></tr><tr><td> Frascos de cultivo celular </td><td> TPP </td><td> 90151 </td><td></td></tr><tr><td> Rascador de la célula </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td> 24 cm </td></tr><tr><td> Salmonella enterica serovar Typhimurium </td><td> ATCC </td><td> 14028 </td><td></td></tr><tr><td> BTX ECM630 Manipulador célula electroquímica </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP308 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino (PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21 a 040 CV </td><td></td></tr><tr><td> Procesador de líquidos por ultrasonidos </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Citocalasina-D </td><td> Sigma-Aldrich, </td><td> C8273 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehído </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td><td></td></tr><tr><td> El tampón de lavado </td><td> 2% de FBS inactivado por calor, 0,1% de azida sódica en PBS. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Perm / tampón de lavado </td><td> BD Biosciences </td><td> 554714 </td><td></td></tr><tr><td> Clear-ver microtubos Cap Snap </td><td> Sigma </td><td> T4816 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 660 phalloidin </td><td> Invitrogen </td><td> A22285 </td><td></td></tr><tr><td> IMAGESTREAM X </td><td> Amnis Corporación </td><td> 100200 </td><td> Opciones: 658nm láser, inyector automático </td></tr><tr><td> Azida de sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S 227i-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry

Sistemas de nanopartículas se han convertido en herramientas valiosas en la entrega de vacunas a través de su capacidad de entregar de manera eficiente la carga, incluyendo las proteínas, las células presentadoras de antígeno 1-5. La internalización de las nanopartículas (NP) por las células presentadoras de antígenos es un paso crítico en la generación de una respuesta inmune efectiva contra el antígeno encapsulado. Para determinar cómo los cambios en la función del impacto de las nanopartículas formulación, hemos tratado de desarrollar un alto rendimiento, cuantitativa protocolo experimental que fuera compatible con la detección de nanopartículas internalizados, así como las bacterias. Hasta la fecha, dos técnicas independientes, microscopía y citometría de flujo, han sido los métodos utilizados para estudiar la fagocitosis de las nanopartículas. La naturaleza de alto rendimiento de la citometría de flujo genera datos estadísticos robustos. Sin embargo, debido a baja resolución, se produce un error de cuantificar con precisión internalizado versus celulares nanopartículas consolidados. Microscopía genera imágenes con alta resolución espacial, hin embargo, es mucho tiempo e involucra a pequeños tamaños de muestra 6-8. Multi-espectral de la citometría de flujo de imágenes (MIFC) es una nueva tecnología que incorpora aspectos tanto de la microscopía y citometría de flujo que realiza multicolor de imágenes espectrales de fluorescencia de campo y brillante al mismo tiempo a través de un núcleo laminar. Esta capacidad proporciona un análisis preciso de la intensidad de la señal fluorescente y las relaciones espaciales entre las diferentes estructuras y funciones celulares a alta velocidad. En este documento, se describe un método que utiliza MIFC para caracterizar las poblaciones celulares que han internalizado las nanopartículas polianhídrido o Salmonella enterica serovar Typhimurium. También describe la preparación de suspensiones de nanopartículas, el etiquetado de células, la adquisición de un sistema de IMAGESTREAM X y análisis de los datos mediante la aplicación de IDEAS. También demuestran la aplicación de una técnica que puede utilizarse para diferenciar la internalización pathways de las nanopartículas y las bacterias mediante el uso de citocalasina-D como un inhibidor de la fagocitosis mediada por actina.

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Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

En este artículo se describe un método que utiliza multi-espectral citometría de flujo de imágenes para cuantificar la internalización de nanopartículas polianhídrido o bacterias de las células RAW 264.7.

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Activación de los macrófagos alveolares murinos recolección y evaluación de celular inducida por nanopartículas polianhidrido

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Investigación

Bioingeniería

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Las nanopartículas virales para<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes de tumores

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Wide-field microscopía de fluorescencia y citometría de flujo fluorescente de imágenes en un teléfono móvil

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Localización y cuantificación relativa de nanotubos de carbono en las células con multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Detección Sensible de Proteopathic Siembra Actividad con FRET Citometría de Flujo

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

Síntesis microondas impulsada de nanopartículas de óxido de hierro para la detección rápida de la aterosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (RGC) por citometría de flujo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Funcionalización superficial de nanopartículas de Virus de Hepatitis E métodos de conjugación química

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Detección de cáncer de ovario mediante citometría de flujo fotoacústico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...