Name: analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2012-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Författarna vill tacka ONR-Muri Award (NN00014-06-1-1176) och den amerikanska armén medicinsk forskning och Materielverk (Grant Numbers W81XWH-09-1-0386 och W81XWH-10-1-0806) för den finansiella stöd.

1. RAW 264,7 Cellodling <ol><li> Harvest RAW 264.7 celler från sina flaskor när de når sammanflytning genom att skrapa dem försiktigt med en cell skrapa. Count och plattan dem i en 24-brunnars cellodlingsskål med en täthet av 5 x 10 5 celler / brunn i 0,5 ml komplett Dulbeccos Modified Eagle Medium (cDMEM; 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 2 mM GlutaMax, och 10 mM HEPES) och inkubera över natten vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. </li></ol> 2. Patogena ...

<ol>
	<li>Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+protective+single-dose+intranasal+nanoparticle-based+vaccine+platform+for+respiratory+infectious+diseases.">Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases.</a> PLoS One. 6, e17642 (2011).</li><li>Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., Garc&#237;a-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+the+magnitude+and+persistence+of+antibody+responses+with+innate+immunity.">Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.</a> Nature. 470, 543-547 (2011).</li><li>Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+particles+in+vaccine+delivery.">Polymeric particles in vaccine delivery.</a> Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).</li><li>Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyanhydrides+as+localized+drug+delivery+carrier:+an+update.">Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update.</a> Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).</li><li>Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino+ester)+micro-+and+nanospheres:+DNA+encapsulation+and+cellular+transfection.">Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection.</a> Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).</li><li>Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numbers+matter:+quantitative+and+dynamic+analysis+of+the+formation+of+an+immunological+synapse+using+imaging+flow+cytometry.">Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).</li><li>Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+phagocytosis+and+bacterial+killing+by+human+neutrophils.">Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils.</a> J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).</li><li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+differentially+modulates+particle+binding,+phagocytosis+and+downstream+antimicrobial+mechanisms.">Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms.</a> Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).</li><li>Murphy, K. C., Campellone, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambda+Red-mediated+recombinogenic+engineering+of+enterohemorrhagic+and+enteropathogenic+E.+coli.">Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli.</a> BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).</li><li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria.">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57, 286-295 (2007).</li><li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres.">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li><li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+endocytosis.">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).</li><li>Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers:+optimization+and+pitfalls.">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li><li>Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-sensitive+non-phospholipid+vesicle+and+macrophage-like+cells:+binding,+uptake+and+endocytotic+pathway.">pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).</li><li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms.">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li></ol>

Studier har visat att bionedbrytbara nanopartiklarna baserade på poly (mjölksyra-sam-glykolsyra (PLGA) eller polyanhydrider kan användas för att leverera antigener inkapslade eller läkemedel till målceller. Upptag av dessa nanopartiklar av fagocytiska celler är viktig för deras effektivitet, vilket gör kvantitativ . analys av internalisering kritisk vid utformning av nya system nanopartiklar leveranssystem Genom att använda denna metod kan differentiell upptag av nanopartiklar av olika celltyper skall analyser...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> RAW 264,7 cellinje </td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> TIB-71 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt bovint serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S 11.150 </td><td> Premiumkvalitet </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> 24-brunnars platta</td><td> TPP </td><td> 92.024 </td><td></td></tr><tr><td> Cellodlings Kolvar </td><td> TPP </td><td> 90.151 </td><td></td></tr><tr><td> Cellskrapa </td><td> TPP </td><td> 99.002 </td><td> 24 cm </td></tr><tr><td> Salmonella enterica serovar typhimurium </td><td> ATCC </td><td> 14.028 </td><td></td></tr><tr><td> BTX ECM630 Electro Cell Manipulator </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP308 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ultraljud vätska processorn </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Cytokalasin-D </td><td> Sigma-Aldrich, </td><td> C8273 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehyd </td><td> Polysciences </td><td> 04.018 </td><td></td></tr><tr><td> Tvättbuffert </td><td> 2% värmeinaktiverat FBS, 0,1% natriumazid i PBS. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Perm / tvättbuffert </td><td> BD Biosciences </td><td> 554.714 </td><td></td></tr><tr><td> Clear-view mikrorör snäpplock </td><td> Sigma </td><td> T4816 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor falloidin 660 </td><td> Invitrogen </td><td> A22285 </td><td></td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis Corporaning </td><td> 100.200 </td><td> Alternativ: 658nm laser, autosampler </td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Fisher Scientific </td><td> S 227I-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry

Nanopartikulära system har visat sig vara värdefulla verktyg i vaccinet levereras genom sin förmåga att effektivt leverera gods, inklusive proteiner, till antigenpresenterande celler 1-5. Internalisering av nanopartiklar (NP) av antigenpresenterande celler är ett kritiskt steg vid generering av en effektiv immunrespons till det inkapslade antigenet. För att bestämma hur förändringar i nanopartikelformulering påverkan funktion, försökte vi utveckla en hög genomströmning, kvantitativ experimentell protokoll som var förenligt med att upptäcka internaliserade nanopartiklar samt bakterier. Hittills har två oberoende tekniker, mikroskopi och flödescytometri, varit de metoder som används för att studera fagocytos av nanopartiklar. Den höga genomströmningen natur flödescytometri genererar tillförlitliga statistiska uppgifter. På grund av låg upplösning, inte att exakt kvantifiera internaliserat kontra cellbundna nanopartiklar. Mikroskopi genererar bilder med hög rumslig upplösning, however, det är tidskrävande och innebär små urvalsstorlekar 6-8. Multispektralt imaging flödescytometri (MIFC) är en ny teknik som inbegriper aspekter av både mikroskopi och flödescytometri som utför flera färger spektral fluorescens och ljusa fältet avbildning samtidigt genom ett laminärt kärna. Denna funktion ger en korrekt analys av fluorescerande signal intensiteter och rumsliga relationer mellan olika strukturer och cellulära funktioner vid hög hastighet. Häri beskriver vi en metod som utnyttjar MIFC att karakterisera cellpopulationer som internaliserade polyanhydrid nanopartiklar eller Salmonella enterica serovar Typhimurium. Vi beskriver också beredningen av nanopartiklar suspensioner, cell märkning, förvärv på en ImageStream X-system och analys av data med hjälp av IDÉER ansökan. Vi visar också att tillämpningen av en teknik som kan användas för att differentiera internalisering pathways för nanopartiklar och bakterier genom användning av cytokalasin-D som en inhibitor av aktin-medierad fagocytos.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

I den här artikeln beskriver vi en metod som utnyttjar multispektralt metri avbildning flöde till kvantifiera internalisering av polyanhydrid nanopartiklar eller bakterier från RAW 264.7 celler.

Analysera Cellulär internalisering av Nanopartiklar och bakterier genom att multispektralt Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Skörd Murina alveolära makrofager och utvärdera cellulär aktivering inducerad av polyanhydrid Nanopartiklar

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Virala Nanopartiklar för<em&gt; In vivo</em&gt; Tumöravbildning

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Utvärdering av polymera Gene Delivery nanopartiklar genom nanopartikel Tracking Analys och hög kapacitet flödescytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Wide-området fluorescensmikroskopi och fluorescerande Imaging flödescytometri på en mobiltelefon

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Lokalisering och relativ kvantifiering av kolnanorör i celler med multispekt flödescytometri

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Känslig detektion av Proteopathic Seeding aktivitet med FRET flödescytometri

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

Mikrovågsugn driven Syntes av järnoxid nanopartiklar för snabb detektion av åderförkalkning

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolering av primära murin retinala Ganglion-celler (RGC) genom flödescytometri

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Ytan funktionalisering av hepatit E Virus nanopartiklar med kemiska konjugation metoder

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Äggstocks cancer detektion med Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...