Name: spectral karyotyping to study chromosome abnormalities in humans and mice with polycystic kidney disease
Uploaded: 2012-02-03T13:00:00
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Autoren möchten sich bei Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi und Blair Mell für ihre technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde durch Auszeichnungen von der NIH (DK080640) und der University of Toledo &amp; ProMedica Translational Research Award an Dr. Stimulation Surya Nauli unterstützt.

1. Zell-Vorbehandlung und Metaphase Vorbereitung <ol><li> Die Zellen werden in Dulbeccos Modifizierung von Eagle-Medium (DMEM), das 10-15% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin bei 37 ° C mit 5% CO 2-Inkubator gewachsen, bis sie 70-80% Konfluenz erreichen. </li><li> Behandeln Sie die Zellen mit Colcemid Lösung bei 0,05 pg / ml für 30-60 min. </li><li> Sammeln Sie das Medium, das keine schwimmenden Zellen in 50-ml sterile Falcon Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Zellen auf der Pl...

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	<li>Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+differentiation+along+metaphase+chromosomes.">Chemical differentiation along metaphase chromosomes.</a> Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).</li><li>Seabright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+banding+technique+for+human+chromosomes.">A rapid banding technique for human chromosomes.</a> Lancet. 2, 971-972 (1971).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).</li><li>Schrock, E., Zschieschang, P., O'Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+of+human,+mouse,+rat+and+ape+chromosomes--applications+for+genetic+diagnostics+and+research.">Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes--applications for genetic diagnostics and research.</a> Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumping+translocations+are+common+in+solid+tumor+cell+lines+and+result+in+recurrent+fusions+of+whole+chromosome+arms.">Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 30, 349-363 (2001).</li><li>Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+chromosome+abnormalities+in+haematological+malignancies+detected+by+multicolour+spectral+karyotyping.">Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping.</a> Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).</li><li>Karpf, A. R., Matsui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disruption+of+cytosine+DNA+methyltransferase+enzymes+induces+chromosomal+instability+in+human+cancer+cells.">Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells.</a> Cancer Research. 65, 8635-8639 (2005).</li><li>Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+spectral+karyotyping+to+the+analysis+of+the+human+chromosome+complement+of+interspecies+somatic+cell+hybrids.">Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids.</a> Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).</li><li>Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+genetic+complementation+controlling+the+chromosomal+abnormalities+and+loss+of+heterozygosity+formation+in+cancer.">A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer.</a> Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).</li><li>Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cytogenetics+revisited:+comparative+genomic+hybridization+and+spectral+karyotyping.">Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping.</a> Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany). 75, 801-814 (1997).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation Research. 104, 860-869 (2009).</li><li>Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystins+1+and+2+mediate+mechanosensation+in+the+primary+cilium+of+kidney+cells.">Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells.</a> Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).</li><li>Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cilia+are+fluid+shear+sensors+that+regulate+calcium+signaling+and+nitric+oxide+production+through+polycystin-1.">Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1.</a> Circulation. 117, 1161-1171 (2008).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+from+humans+and+mice+with+polycystic+kidney+disease+are+characterized+by+polyploidy+and+chromosome+segregation+defects+through+survivin+down-regulation.">Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation.</a> Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cytogenetic+analysis+of+the+bladder+carcinoma+cell+line+BK-10+by+spectral+karyotyping.">Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 25, 53-59 (1999).</li></ol>

Spektrale Karyotypisierung (SKY) ist eine Technik bei der Untersuchung Zytogenetik genomische und chromosomale Zusammensetzungen verwendet. Diese Technik nutzt die Vorteile von Chromosom Malerei Sonden, und die Detektion dieser Sonden durchstöberst einem Sagnac-Interferometers erfasst. Die komplette SKY Prozess dauert etwa eine Woche, und es sind mehrere wichtige Schritte (Abbildung 1). Die SKY mit einem Standardprotokoll, das zuerst von Padilla-Nash et al 3 beschrieben wurde. Das P...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro Mediatech Inc. </td><td> 10 bis 013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30088-03 </td><td></td></tr><tr><td> Penecillin / Streptomycin </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Colcemid </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 295 892 001 </td><td> 10 pg / ml </td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S77375-1 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphatgepufferte Kochsalzlösung </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256-01 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Himmel zu malen Probe Kit (Human) </td><td> Applied Spectral Imaging </td><td> SKY000028 </td><td></td></tr><tr><td> Himmel zu malen Probe Kit (Maus) </td><td> Applied Spectral Imaging </td><td> SKY000030 </td><td></td></tr><tr><td> Konzentrierte Antikörper-Nachweis-Kit </td><td> Applied Spectral Imaging </td><td> SKY000033 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30236.01 </td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A433P-4 </td><td></td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> Fisher Scientific </td><td> A38-212 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 109 169 001 </td><td></td></tr><tr><td> Pepsin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6887-5G </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Fluka </td><td> 63069-500ML </td><td></td></tr><tr><td> 37% Formaldehyd </td><td> Mallinckrodt Baker </td><td> 2106-02 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Promega </td><td> V4261 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Fluka </td><td> 47671 </td><td> Vorbereitung unmittelbar vor Gebrauch </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Objektträger </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Deckglas 24x60mm </td><td> VWR Vista Vision </td><td> 16004-312 </td><td></td></tr><tr><td> Gummi-Zement </td><td> Elmer in die (lokalen Retail Store) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hybridisierung / humidifiedchamber / Fach </td><td> Simport </td><td> M920-2 </td><td> nasse Papiertücher an der Unterseite </td></tr><tr><td> ThermoCycler </td><td> Eppendorf </td><td> Epgradient S </td><td></td></tr><tr><td> / TwinCubator Orbitalschüttler </td><td> Bellco Biotechnologie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schütteln / Wasserbad </td><td> Precision Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DAPI Filterwürfel </td><td> Chroma Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SKY Filterwürfel </td><td> Chroma Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SpectraCube </td><td> Applied Spectral Imaging </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inverted Zellkultur Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Nikon Eclipse TS100 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop </td><td> Olymp </td><td> IX70 </td><td> 60X Öl </td></tr></tbody></table>

spectral karyotyping to study chromosome abnormalities in humans and mice with polycystic kidney disease

Konventionelle Methode zum Identifizieren und Klassifizieren einzelnen Chromosomen hängt von der einzigartigen Bandenmuster jedes Chromosoms einer bestimmten Tierart zu analysierenden 1, 2. Diese klassische Banding-Technik, ist aber nicht bei der Identifizierung von komplexen chromosomalen Aberrationen, wie sie im Zusammenhang mit Krebs zuverlässig. Um die Einschränkungen des Banding-Technik zu überwinden, wird Spektrale Karyotypisierung (SKY) eingeführt, um viel zuverlässige Informationen über Chromosomenanomalien bieten. SKY ist eine multicolor Fluoreszenz-in-situ Hybridisierung (FISH) Technik, um Metaphasen-Chromosomen mit spektralen Mikroskop 3, 4 zu erfassen. SKY ist nachgewiesen worden, ein wertvolles Werkzeug für die zytogenetische Analyse eines breiten Spektrums von Chromosomenanomalien mit einer großen Anzahl von genetischen Erkrankungen und Malignome 5, 6 verbunden sein. SKY umfasst die Verwendung von Multicolor-fluoreszierend markierten DNA-Sonden aus dem entarteten Oligonucleotid hergestelltotide Primern durch PCR. Somit hat jeder Chromosom einen einzigartigen spektralen Farbe nach in-situ-Hybridisierung mit Sonden, die differentiell mit einem Gemisch von Fluoreszenzfarbstoffen (Rhodamin, Texas Red, Cy5, FITC und Cy5.5) so gekennzeichnet sind. Die Sonden für SKY verwendet werden, bestehen aus bis zu 55 Chromosomen-spezifischen Sonden 10.07. Das Verfahren für SKY umfasst mehrere Schritte (Abbildung 1). SKY erfordert die Verfügbarkeit von Zellen mit hoher Mitoseindex von normalen oder erkrankten Gewebe oder Blut. Die Chromosomen einer einzelnen Zelle entweder von einem frisch isolierten-Primär-Zelle oder einer Zellinie werden auf einem Glas-Objektträger ausgestrichen. Dieses Chromosom Ausbreitung wird mit einer unterschiedlichen Kombination von Fluoreszenzfarbstoffen spezifisch für jedes Chromosom markiert. Für Sonde Detektion und Bildaufnahme, besteht die Spectral Imaging System der Sagnac-Interferometer und einer CCD-Kamera. Diese erlaubt die Messung der sichtbaren Lichtspektrums von der Probe emittiert und einen spektralen Bild her zu erwerbenm einzelnen Chromosomen. HiSKY, bietet die Software verwendet, um die Ergebnisse der erfassten Bilder zu analysieren, eine leichte Identifizierung von Chromosomenanomalien. Das Endergebnis ist eine Metaphase und ein Karyotyp Klassifizierung Bildes, bei dem jedes Paar von Chromosomen hat eine bestimmte Farbe (Abbildung 2). Dies ermöglicht eine einfache Identifizierung des Chromosoms Identitäten und Translokationen. Für weitere Informationen, besuchen Sie bitte Applied Spectral Imaging Website ( <a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a> ). SKY wurde vor kurzem für eine Identifizierung von Chromosomensegregation Mängel und Chromosomenanomalien bei Menschen und Mäusen mit autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD), eine genetische Erkrankung, die durch Funktionsstörungen bei primären Zilien 11-13 gekennzeichnet werden. Mit dieser Technik konnten wir zeigen, das Vorhandensein von abnormen Chromosom Segregation und Chromosomenstörungen in ADPKD Patienten und Mausmodellen 14. Weitere Analysen unter Verwendung SKY nicht nur erlaubt uns, chromosomalen Teilnummer und identifizieren zu identifizieren, sondern auch genau zu erfassen, sehr komplex chromosomalen Abweichungen wie Chromosom Deletionen und Translokationen (Abbildung 2).

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Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Spektrale Karyotypisierung (SKY) ist eine fortgeschrittene Technik, um Zytogenetik genomischen und chromosomalen Aberrationen zu identifizieren. Diese Technik nutzt die Vorteile von Chromosom Malerei Sonden, die es erlauben die Einstufung aller Chromosomen. SKY kann auch identifiziert werden komplexe Chromosomenaberrationen und Segregation Defekte in Mäusen und Menschen mit verschiedenen Krankheiten, einschließlich Zystennieren.

Spektrale Karyotypisierung zu Chromosomenanomalien in Menschen und Mäusen mit Kidney Disease Study

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Orthotopen Aortic Transplantation in Mäuse für das Studium der Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Forschung

Medizin

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th Nephrektomie in Kombination mit hohen Salz-Diät-und Stickstoffmonoxid-Synthase-Hemmung zu Chronic Kidney Disease in der Lewis-Ratte induzieren

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Beurteilung der Gefäßfunktion bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Eine mögliche Zebrafisch-Modell der Kidney Disease: Knockdown von<em&gt; Wnt5a</em&gt; Ursachen Zysten in Zebrafisch-Nieren

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Adapting Human Videofluoroscopic Swallow Study Methods to Detect and Characterize Dysphagia in Murine Disease Models

Anpassung Menschen Videofluoroscopic Swallow Studienmethoden nachgewiesen und charakterisiert Dysphagie in Murine Krankheitsmodelle

This study adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Verwendung Adeno-assoziierte Virus als Werkzeug Retinal Barrieren in Disease Study

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Verwendung von Ultrahochfeld-MRT in Kleintier Modelle aus Polyzystische Nierenerkrankung für<em&gt; In Vivo</em&gt; Phänotypisierung und Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Chirurgische Modelle aus gastroösophagealen Reflux mit Mäusen

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Symmetrische Bihemispheric Postmortem Gehirn Schneiden Gesund und krankhafte Gehirnbedingungen beim Menschen zu studieren

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

Ein Modell Simulieren von klinisch relevanter Hypoxie beim Menschen

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...