Name: spectral karyotyping to study chromosome abnormalities in humans and mice with polycystic kidney disease
Uploaded: 2012-02-03T13:00:00
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Gli autori ringraziano Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi e Blair Mell per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da premi dal NIH (DK080640) e The University of Translational Research Award stimolazione Toledo &amp; Promedica al dottor Surya Nauli.

1. Cella pretrattamento e la preparazione metafase <ol><li> Le cellule sono cresciute in modif Dulbeccòs di Medio di Eagle (DMEM) contenente 10-15% siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina / streptomicina a 37 ° C con 5% CO 2 incubatore, fino a raggiungere 70-80% confluenza. </li><li> Trattare le cellule con soluzione Colcemid a 0,05 ug / ml per 30-60 min. </li><li> Raccogliere il terreno contenente le cellule galleggianti da 50 ml sterili provette Falcon. Lavare le cellule sulla piastra con sterile1X-P...

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	<li>Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+differentiation+along+metaphase+chromosomes.">Chemical differentiation along metaphase chromosomes.</a> Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).</li><li>Seabright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+banding+technique+for+human+chromosomes.">A rapid banding technique for human chromosomes.</a> Lancet. 2, 971-972 (1971).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).</li><li>Schrock, E., Zschieschang, P., O'Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+of+human,+mouse,+rat+and+ape+chromosomes--applications+for+genetic+diagnostics+and+research.">Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes--applications for genetic diagnostics and research.</a> Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumping+translocations+are+common+in+solid+tumor+cell+lines+and+result+in+recurrent+fusions+of+whole+chromosome+arms.">Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 30, 349-363 (2001).</li><li>Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+chromosome+abnormalities+in+haematological+malignancies+detected+by+multicolour+spectral+karyotyping.">Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping.</a> Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).</li><li>Karpf, A. R., Matsui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disruption+of+cytosine+DNA+methyltransferase+enzymes+induces+chromosomal+instability+in+human+cancer+cells.">Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells.</a> Cancer Research. 65, 8635-8639 (2005).</li><li>Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+spectral+karyotyping+to+the+analysis+of+the+human+chromosome+complement+of+interspecies+somatic+cell+hybrids.">Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids.</a> Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).</li><li>Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+genetic+complementation+controlling+the+chromosomal+abnormalities+and+loss+of+heterozygosity+formation+in+cancer.">A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer.</a> Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).</li><li>Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cytogenetics+revisited:+comparative+genomic+hybridization+and+spectral+karyotyping.">Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping.</a> Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany). 75, 801-814 (1997).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation Research. 104, 860-869 (2009).</li><li>Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystins+1+and+2+mediate+mechanosensation+in+the+primary+cilium+of+kidney+cells.">Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells.</a> Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).</li><li>Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cilia+are+fluid+shear+sensors+that+regulate+calcium+signaling+and+nitric+oxide+production+through+polycystin-1.">Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1.</a> Circulation. 117, 1161-1171 (2008).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+from+humans+and+mice+with+polycystic+kidney+disease+are+characterized+by+polyploidy+and+chromosome+segregation+defects+through+survivin+down-regulation.">Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation.</a> Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cytogenetic+analysis+of+the+bladder+carcinoma+cell+line+BK-10+by+spectral+karyotyping.">Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 25, 53-59 (1999).</li></ol>

Cariotipo spettrale (SKY) è una tecnica utilizzata nello studio di citogenetica composizioni genomiche e cromosomiche. Questa tecnica si avvale di sonde cromosoma pittura, e il rilevamento di queste sonde sono stati acquisiti tramite un interferometro di Sagnac. Il processo di SKY completo dura di solito circa una settimana, e coinvolge diversi passaggi chiave (Figura 1). La SKY utilizza un protocollo standard, che è stato descritto da Padilla-Nash et al 3. Il protocollo è stato p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro Mediatech Inc. </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Siero bovino fetale (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30088-03 </td><td></td></tr><tr><td> Penecillin / streptomicina </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Colcemid </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 295 892 001 </td><td> 10 pg / ml </td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S77375-1 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato soluzione salina tamponata </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256-01 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> SKY paint kit sonda (Human) </td><td> Applicata Imaging Spectral </td><td> SKY000028 </td><td></td></tr><tr><td> SKY vernice sonda kit (mouse) </td><td> Applicata Imaging Spectral </td><td> SKY000030 </td><td></td></tr><tr><td> Concentrato kit per il rilevamento degli anticorpi </td><td> Applicata Imaging Spectral </td><td> SKY000033 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30236.01 </td><td></td></tr><tr><td> Metanolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> A433P-4 </td><td></td></tr><tr><td> Acido acetico </td><td> Fisher Scientific </td><td> A38-212 </td><td></td></tr><tr><td> RNasi A </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 109 169 001 </td><td></td></tr><tr><td> Pepsina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6887-5G </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Fluka </td><td> 63069-500ML </td><td></td></tr><tr><td> 37% Formaldeide </td><td> Mallinckrodt Baker </td><td> 2106-02 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Promega </td><td> V4261 </td><td></td></tr><tr><td> Formammide </td><td> Fluka </td><td> 47671 </td><td> Preparare al momento dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio diapositive di vetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio copertura in vetro 24x60mm </td><td> VWR Vista Vision </td><td> 16004-312 </td><td></td></tr><tr><td> Mastice </td><td> Elmer (locali negozio al dettaglio) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ibridizzazione / humidifiedchamber / Tray </td><td> Simport </td><td> M920-2 </td><td> mettere gli asciugamani di carta bagnati in fondo </td></tr><tr><td> Thermocycler </td><td> Eppendorf </td><td> Epgradient S </td><td></td></tr><tr><td> Scuotendo la piattaforma / Agitatore orbitale </td><td> Bellco Biotecnologie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Scuotendo bagno / acqua </td><td> Rigore scientifico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DAPI filtro cubo </td><td> Tecnologia Chroma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SKY filtro cubo </td><td> Tecnologia Chroma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SpectraCube </td><td> Applicata Imaging Spectral </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inverted cella microscopio cultura </td><td> Nikon </td><td> Nikon Eclipse TS100 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Olimpo </td><td> IX70 </td><td> Olio 60X </td></tr></tbody></table>

spectral karyotyping to study chromosome abnormalities in humans and mice with polycystic kidney disease

Metodo convenzionale per identificare e classificare i singoli cromosomi dipende dal modello unico bande di ciascun cromosoma in una determinata specie in fase di analisi 1, 2. Questa tecnica classica banding, tuttavia, non è affidabile nell&#39;identificare complesse aberrazioni cromosomiche come quelle associate con il cancro. Per superare i limiti della tecnica banding, cariotipo spettrale (SKY) viene introdotto per fornire molte informazioni affidabili sulle anomalie cromosomiche. SKY è una fluorescenza multicolor ibridazione in situ (FISH), tecnica per rilevare cromosomi in metafase, con microscopio spettrale 3, 4. SKY ha dimostrato di essere uno strumento prezioso per l&#39;analisi citogenetica di una vasta gamma di anomalie cromosomiche associate con un gran numero di malattie genetiche e tumori maligni 5, 6. SKY implica l&#39;uso di sonde di DNA multicolor marcato in fluorescenza preparati dal degenerato oligonucleprimers otide mediante PCR. Così, ogni cromosoma ha un colore univoco spettrale dopo in-situ ibridazione con sonde, che sono differenzialmente etichettati con una miscela di coloranti fluorescenti (Rodamina, Texas Red, Cy5, FITC e Cy5.5). Le sonde utilizzate per SKY contenere fino a 55 sonde cromosoma specifiche 7-10. La procedura per SKY prevede diversi passaggi (Figura 1). SKY richiede la disponibilità di cellule con elevato indice mitotico da tessuto normale o malato o di sangue. I cromosomi di una cellula singola da o una cella isolate di fresco primaria o una linea cellulare sono diffuse su un vetrino. Questo spread cromosoma è etichettato con una diversa combinazione di coloranti fluorescenti specifici per ciascun cromosoma. Per il rilevamento sonda e acquisizione delle immagini, il sistema di imaging spettrale consiste di interferometro Sagnac e una telecamera CCD. Questo permette misurazione dello spettro di luce visibile emessa dal campione e di acquisire una immagine spettrale frocromosomi m individuali. HiSKY, il software utilizzato per analizzare i risultati delle immagini catturate, fornisce una facile identificazione di anomalie cromosomiche. Il risultato finale è uno metafase e una immagine classificazione cariotipo, in cui ciascuna coppia di cromosomi ha un colore distinto (Figura 2). Questo permette una facile identificazione delle identità e le traslocazioni cromosomiche. Per ulteriori informazioni, visitare il sito Applied Spectral Imaging ( <a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a> ). SKY è stato recentemente utilizzato per l&#39;identificazione di difetti segregazione dei cromosomi e le anomalie cromosomiche negli esseri umani e nei topi con malattia autosomica dominante del rene policistico (ADPKD), una malattia genetica caratterizzata da una disfunzione in cilia primaria 11-13. Utilizzando questa tecnica, abbiamo dimostrato la presenza di segregazione dei cromosomi anormali e difetti cromosomici in pazienti ADPKD e modelli di topo 14. Ulteriori analisi basate SKY non solo ci ha permesso di identificare il numero cromosomico e identità, ma anche per rilevare con precisione le aberrazioni cromosomiche molto complessi come le delezioni e le traslocazioni cromosomiche (Figura 2).

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Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Cariotipo spettrale (SKY) è una tecnica avanzata citogenetica per individuare aberrazioni genomiche e cromosomiche. Questa tecnica si avvale di sonde cromosomiche pittura, che permettono la classificazione di tutti i cromosomi. SKY può anche identificare aberrazioni cromosomiche complesse e difetti segregazione nei topi e nell&#39;uomo con varie patologie, tra cui la malattia del rene policistico.

Cariotipo spettrale allo studio anomalie cromosomiche negli esseri umani e nei topi con malattia del rene policistico

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

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