Name: spectral karyotyping to study chromosome abnormalities in humans and mice with polycystic kidney disease
Uploaded: 2012-02-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi og Blair Mell for deres tekniske assistanse. Dette arbeidet ble støttet av utmerkelser fra NIH (DK080640) og The University of Toledo &amp; ProMedica translasjonsforskning Stimulering Award til Dr. Surya Nauli.

1. Cell forbehandling og metafase forberedelse <ol><li> Cellene er dyrket i Dulbecco sin Endring av Ørns Medium (DMEM) som inneholder 10-15% fosterets storfe serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin ved 37 ° C med 5% CO 2 inkubator, inntil de når 70-80% confluency. </li><li> Unn cellene med colcemid løsning på 0,05 mikrogram / ml i 30-60 min. </li><li> Samle medium med eventuelle flytende cellene i 50 ml sterile falcon sentrifugerør. Skyll cellene på tallerkenen med sterile1X-PBS. Etter inkubasjon...

<ol>
	<li>Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+differentiation+along+metaphase+chromosomes.">Chemical differentiation along metaphase chromosomes.</a> Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).</li><li>Seabright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+banding+technique+for+human+chromosomes.">A rapid banding technique for human chromosomes.</a> Lancet. 2, 971-972 (1971).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).</li><li>Schrock, E., Zschieschang, P., O'Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+of+human,+mouse,+rat+and+ape+chromosomes--applications+for+genetic+diagnostics+and+research.">Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes--applications for genetic diagnostics and research.</a> Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumping+translocations+are+common+in+solid+tumor+cell+lines+and+result+in+recurrent+fusions+of+whole+chromosome+arms.">Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 30, 349-363 (2001).</li><li>Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+chromosome+abnormalities+in+haematological+malignancies+detected+by+multicolour+spectral+karyotyping.">Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping.</a> Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).</li><li>Karpf, A. R., Matsui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disruption+of+cytosine+DNA+methyltransferase+enzymes+induces+chromosomal+instability+in+human+cancer+cells.">Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells.</a> Cancer Research. 65, 8635-8639 (2005).</li><li>Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+spectral+karyotyping+to+the+analysis+of+the+human+chromosome+complement+of+interspecies+somatic+cell+hybrids.">Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids.</a> Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).</li><li>Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+genetic+complementation+controlling+the+chromosomal+abnormalities+and+loss+of+heterozygosity+formation+in+cancer.">A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer.</a> Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).</li><li>Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cytogenetics+revisited:+comparative+genomic+hybridization+and+spectral+karyotyping.">Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping.</a> Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany). 75, 801-814 (1997).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation Research. 104, 860-869 (2009).</li><li>Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystins+1+and+2+mediate+mechanosensation+in+the+primary+cilium+of+kidney+cells.">Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells.</a> Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).</li><li>Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cilia+are+fluid+shear+sensors+that+regulate+calcium+signaling+and+nitric+oxide+production+through+polycystin-1.">Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1.</a> Circulation. 117, 1161-1171 (2008).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+from+humans+and+mice+with+polycystic+kidney+disease+are+characterized+by+polyploidy+and+chromosome+segregation+defects+through+survivin+down-regulation.">Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation.</a> Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cytogenetic+analysis+of+the+bladder+carcinoma+cell+line+BK-10+by+spectral+karyotyping.">Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 25, 53-59 (1999).</li></ol>

Spectral Karyotyping (SKY) er en cytogenetikk teknikk som brukes i å studere genomisk og kromosomal komposisjoner. Denne teknikken tar nytte av kromosom maleri sonder, og påvisning av disse sonder er anskaffet gjennom en sagnac interferometer. Den komplette SKY prosessen tar vanligvis omtrent en uke, og det innebærer flere viktige trinn (figur 1). SKY bruker en standard protokoll, som først ble beskrevet av Padilla-Nash et al tre. Protokollen har siden blitt bearbeidet av ulike c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro Mediatech Inc. </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Fetal bovin serum (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30088-03 </td><td></td></tr><tr><td> Penecillin / Streptomycin </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Colcemid </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 295 892 001 </td><td> 10 mikrogram / ml </td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S77375-1 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfatbufret saltvann </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256-01 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> SKY maling probe kit (Human) </td><td> Applied Spectral Imaging </td><td> SKY000028 </td><td></td></tr><tr><td> SKY maling probe kit (mus) </td><td> Applied Spectral Imaging </td><td> SKY000030 </td><td></td></tr><tr><td> Konsentrert antistoff påvisning kit </td><td> Applied Spectral Imaging </td><td> SKY000033 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30236.01 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A433P-4 </td><td></td></tr><tr><td> Eddiksyre </td><td> Fisher Scientific </td><td> A38-212 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 109 169 001 </td><td></td></tr><tr><td> Pepsin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6887-5G </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Fluka </td><td> 63069-500ML </td><td></td></tr><tr><td> 37% Formaldehyd </td><td> Mallinckrodt Baker </td><td> 2106-02 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Promega </td><td> V4261 </td><td></td></tr><tr><td> Formamide </td><td> Fluka </td><td> 47671 </td><td> forberede like før bruk </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop glassplater </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope cover glass 24x60mm </td><td> VWR Vista Vision </td><td> 16004-312 </td><td></td></tr><tr><td> Gummi sement </td><td> Elmer om (lokal forhandler) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hybridisering / humidifiedchamber / skuff </td><td> Simport </td><td> M920-2 </td><td> Legg våte papirhåndklær nederst </td></tr><tr><td> Thermocycler </td><td> Eppendorf </td><td> Epgradient S </td><td></td></tr><tr><td> Risting plattform / Orbital shaker </td><td> Bellco Bioteknologi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Risting / vannbad </td><td> Precision Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DAPI filter kube </td><td> Chroma Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SKY filter kube </td><td> Chroma Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SpectraCube </td><td> Applied Spectral Imaging </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inverted cellekultur mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Nikon Eclipse TS100 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescens mikroskop </td><td> Olympus </td><td> IX70 </td><td> 60X olje </td></tr></tbody></table>

spectral karyotyping to study chromosome abnormalities in humans and mice with polycystic kidney disease

Konvensjonell metode for å identifisere og klassifisere de enkelte kromosomer avhenger unike striper mønster av hvert kromosom i en bestemt art blir analysert 1, 2. Denne klassiske banding teknikk, derimot, er ikke pålitelig i å identifisere komplekse kromosomavvik som de assosiert med kreft. For å overvinne begrensninger av den banding teknikk, Spectral Karyotyping (SKY) innført for å gi mye pålitelig informasjon om kromosomfeil. SKY er en flerfarget fluorescens in-situ hybridisering (FISH) teknikk for å oppdage Metafasekromosomer med spektral mikroskop 3, 4. SKY har vist seg å være et verdifullt verktøy for cytogenetisk analyse av et bredt spekter av kromosomfeil forbundet med et stort antall genetiske sykdommer og malignitet 5, 6. SKY innebærer bruk av flerfarget fluorescently-merket DNA prober fremstilt fra den degenererte oligonucleotide primere med PCR. Dermed har hver kromosom en unik spektral farge etter in-situ hybridisering med prober, som er ulikt merket med en blanding av fluorescerende fargestoffer (Rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC og Cy5.5). Sondene brukes til SKY bestå av opptil 55 kromosom spesifikke probene 7-10. Prosedyren for SKY involverer flere trinn (figur 1). SKY krever tilgjengelighet av celler med høy mitotisk indeks fra normal eller sykt vev eller blod. Kromosomene i en enkelt celle fra enten en fersk isolert primær celle eller en cellelinje er spredt på en glass-slide. Dette kromosom spredningen er merket med en annen kombinasjon av fluorescerende fargestoffer spesifikke for hvert kromosom. For probe deteksjon og bilde oppkjøpet består spektral avbildning system av sagnac interferometer og en CCD-kamera. Dette gjør måling av det synlige lysspekteret slippes ut fra prøven og å skaffe en spektral bilde from enkelte kromosomer. HiSKY, leverer programvaren som brukes til å analysere resultatene av bildene, en enkel identifisering av kromosom anomalier. Sluttresultatet er en metafase og en karyotype klassifisering bilde, der hver kromosompar har en distinkt farge (figur 2). Dette gir enkel identifisering av kromosom identiteter og translokasjoner. For mer informasjon, vennligst besøk Applied Spectral Imaging nettsted ( <a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a> ). SKY ble nylig brukt til en identifisering av kromosom segregering defekter og kromosomfeil hos mennesker og mus med autosomal dominant polycystisk nyresykdom (ADPKD), en genetisk sykdom karakterisert ved dysfunksjon i primær cilia 11-13. Ved hjelp av denne teknikken, viste vi tilstedeværelse av unormale kromosom segregasjon og kromosomavvik defekter i ADPKD pasienter og musemodeller 14. Videre analyser ved hjelp av SKY ikke bare tillot oss å identifisere kromosomal antall og identitet, men også til nøyaktig oppdage svært komplekse kromosomavvik som kromosom slettinger og translokasjoner (figur 2).

Watch this Scientific Journal Video about Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease at JoVE.com

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Spectral Karyotyping (SKY) er en avansert cytogenetikk teknikk for å identifisere genomisk og kromosomavvik. Denne teknikken tar nytte av kromosom maleri sonder, som lar klassifisering av alle kromosomer. SKY kan også identifisere komplekse kromosomavvik og segregering mangler i mus og mennesker med ulike sykdommer, inkludert polycystisk nyresykdom.

Spectral Karyotyping å studere kromosomfeil i mennesker og mus med polycystisk nyresykdom

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Orthotopic Aorta Transplantasjon i Mus for studiet av vaskulær sykdom

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th Nephrectomy i kombinasjon med høy Salt Kosthold og nitrogenoksidsyntase Hemming å indusere kronisk nyresykdom i Lewis Rat

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Vurdering av vaskulær funksjon hos pasienter med kronisk nyresykdom

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

En Mulig Sebrafisk Modell av Polycystisk Nyresykdom: knockdown av<em&gt; Wnt5a</em&gt; Årsaker Cyster i sebrafisk Nyrer

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Adapting Human Videofluoroscopic Swallow Study Methods to Detect and Characterize Dysphagia in Murine Disease Models

Tilpasse menneske Videofluoroscopic Swallow Study Metoder for å påvise og karakterisere Dysfagi i murine sykdomsmodeller

This study adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Ved hjelp adenoassosiert virus som et verktøy for å studere Retinal Barrierer i Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Bruk av Ultra-high Feltet MR i smågnager modeller av Polycystisk nyresykdom for<em&gt; I Vivo</em&gt; Fenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Kirurgiske modeller av gastroøsofageal refluks med Mus

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Symmetrisk Bihemispheric Post mortem Brain Cutting å studere Sunn og patologiske hjerne tilstander i mennesker

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

En modell for å simulere klinisk relevant Hypoksi i Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...