Name: spectral karyotyping to study chromosome abnormalities in humans and mice with polycystic kidney disease
Uploaded: 2012-02-03T13:00:00
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Os autores gostariam de agradecer Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi e Blair Mell para a sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH (DK080640) e da Universidade de Toledo &amp; ProMedica Prêmio Estímulo à Pesquisa Translacional Dr. Surya Nauli.

1. Pré-tratamento de célula e preparação metáfase <ol><li> As células são cultivadas em alteraç de Dulbecco de Medium de Eagle (DMEM) contendo 10-15% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina a 37 ° C, com 5% de CO 2 incubadora, até que eles chegar a 70-80% de confluência. </li><li> Trate as células com solução de Colcemid em 0,05 ug / ml para 30-60 min. </li><li> Recolher o meio contendo as células de flutuação em tubos estéreis de 50 ml de centrífuga de falcão. Lav...

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	<li>Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+differentiation+along+metaphase+chromosomes.">Chemical differentiation along metaphase chromosomes.</a> Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).</li><li>Seabright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+banding+technique+for+human+chromosomes.">A rapid banding technique for human chromosomes.</a> Lancet. 2, 971-972 (1971).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).</li><li>Schrock, E., Zschieschang, P., O'Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+of+human,+mouse,+rat+and+ape+chromosomes--applications+for+genetic+diagnostics+and+research.">Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes--applications for genetic diagnostics and research.</a> Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumping+translocations+are+common+in+solid+tumor+cell+lines+and+result+in+recurrent+fusions+of+whole+chromosome+arms.">Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 30, 349-363 (2001).</li><li>Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+chromosome+abnormalities+in+haematological+malignancies+detected+by+multicolour+spectral+karyotyping.">Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping.</a> Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).</li><li>Karpf, A. R., Matsui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disruption+of+cytosine+DNA+methyltransferase+enzymes+induces+chromosomal+instability+in+human+cancer+cells.">Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells.</a> Cancer Research. 65, 8635-8639 (2005).</li><li>Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+spectral+karyotyping+to+the+analysis+of+the+human+chromosome+complement+of+interspecies+somatic+cell+hybrids.">Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids.</a> Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).</li><li>Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+genetic+complementation+controlling+the+chromosomal+abnormalities+and+loss+of+heterozygosity+formation+in+cancer.">A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer.</a> Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).</li><li>Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cytogenetics+revisited:+comparative+genomic+hybridization+and+spectral+karyotyping.">Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping.</a> Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany). 75, 801-814 (1997).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation Research. 104, 860-869 (2009).</li><li>Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystins+1+and+2+mediate+mechanosensation+in+the+primary+cilium+of+kidney+cells.">Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells.</a> Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).</li><li>Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cilia+are+fluid+shear+sensors+that+regulate+calcium+signaling+and+nitric+oxide+production+through+polycystin-1.">Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1.</a> Circulation. 117, 1161-1171 (2008).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+from+humans+and+mice+with+polycystic+kidney+disease+are+characterized+by+polyploidy+and+chromosome+segregation+defects+through+survivin+down-regulation.">Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation.</a> Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cytogenetic+analysis+of+the+bladder+carcinoma+cell+line+BK-10+by+spectral+karyotyping.">Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 25, 53-59 (1999).</li></ol>

Cariotipagem espectral (SKY) é uma técnica utilizada em citogenética estudar composições genômicas e cromossômicas. Essa técnica leva vantagem das sondas de pintura de cromossomos, ea detecção destas sondas são adquiridas através de um interferômetro de Sagnac. O processo de SKY completa geralmente leva cerca de uma semana, e ele, envolve várias etapas-chave (Figura 1). A SKY usa um protocolo padrão, que foi primeiramente descrita por Padilla-Nash et al 3. O protocolo ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro Mediatech Inc. </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Fetal de soro de bovino (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30088-03 </td><td></td></tr><tr><td> Penecillin Estreptomicina / </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Colcemid </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 295 892 001 </td><td> 10 ug / ml </td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S77375-1 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de solução salina tamponada com </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256-01 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> SKY pintura sonda kit (Humana) </td><td> Aplicado imagem espectral </td><td> SKY000028 </td><td></td></tr><tr><td> SKY pintura sonda kit (Mouse) </td><td> Aplicado imagem espectral </td><td> SKY000030 </td><td></td></tr><tr><td> Kit de detecção de Concentrada anticorpo </td><td> Aplicado imagem espectral </td><td> SKY000033 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30236.01 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A433P-4 </td><td></td></tr><tr><td> O ácido acético </td><td> Fisher Scientific </td><td> A38-212 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 109 169 001 </td><td></td></tr><tr><td> Pepsina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6887-5G </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Fluka </td><td> 63069-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Formaldeído 37% </td><td> Mallinckrodt Baker </td><td> 2106-02 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Promega </td><td> V4261 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida </td><td> Fluka </td><td> 47671 </td><td> preparar pouco antes de usar </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> Vidro lâminas de microscópio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio tampa de vidro 24x60mm </td><td> VWR Vista Visão </td><td> 16004-312 </td><td></td></tr><tr><td> Borracha cimento </td><td> Elmer (loja de varejo local) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hibridação humidifiedchamber / / Bandeja </td><td> Simport </td><td> M920-2 </td><td> colocar toalhas de papel molhadas no fundo </td></tr><tr><td> Thermociclista </td><td> Eppendorf </td><td> Epgradient S </td><td></td></tr><tr><td> Plataforma de agitação / agitador orbital </td><td> Bélico Biotecnologia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agitando banheira / água </td><td> Precisão científica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DAPI cubo filtro </td><td> Tecnologia Chroma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SKY cubo filtro </td><td> Tecnologia Chroma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SpectraCube </td><td> Aplicado imagem espectral </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscópio invertido cultura de células </td><td> Nikon </td><td> Nikon Eclipse TS100 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Olimpo </td><td> IX70 </td><td> Óleo de 60X </td></tr></tbody></table>

spectral karyotyping to study chromosome abnormalities in humans and mice with polycystic kidney disease

Método convencional para identificar e classificar cromossomos individuais depende do padrão único de bandagem de cada cromossomo em uma espécie específicos que estão sendo analisados ​​1, 2. Esta técnica clássica de bandagem, no entanto, não é confiável na identificação de complexos aberrações cromossômicas, tais como aqueles associados com o câncer. Para superar as limitações da técnica de anilhamento, cariotipagem espectral (SKY) é introduzido para fornecer informações confiáveis ​​tanto em anormalidades cromossômicas. SKY é uma fluorescência multicolor hibridização in-situ (FISH) técnica para detectar cromossomos em metafase, com microscópio espectral 3, 4. SKY tem sido comprovada para ser uma ferramenta valiosa para a análise citogenética de uma ampla gama de anormalidades cromossômicas associados com um grande número de doenças genéticas e doenças malignas 5, 6. SKY envolve o uso de sondas de DNA multicolor fluorescentemente-com o Rótulo preparados a partir de o oligonucle degenerarprimers otide por PCR. Assim, cada cromossoma tem uma cor exclusiva espectral depois de hibridização in-situ com sondas, que são diferencialmente rotulados com uma mistura de corantes fluorescentes (Rodamina, Texas Vermelho, Cy5, FITC e Cy5.5). As sondas utilizadas para SKY consistir de até 55 sondas cromossômicas específicas 7-10. O procedimento para a SKY envolve várias etapas (Figura 1). SKY exige a disponibilidade de células com alto índice mitótico a partir de tecido normal ou doente ou sangue. Os cromossomos de uma única célula a partir de qualquer célula de um recém-isolado primária ou uma linha de células estão espalhados em um slide de vidro. Esse spread cromossomo é rotulado com uma combinação diferente de corantes fluorescentes específicos para cada cromossomo. Para a detecção da sonda e de aquisição de imagem, o sistema de imagem espectral consiste de interferômetro de Sagnac e uma câmera CCD. Este permite a medição do espectro de luz visível emitida a partir da amostra e para adquirir uma imagem espectral frocromossomos m individuais. HiSKY, o software usado para analisar os resultados das imagens capturadas, proporciona uma fácil identificação de anomalias cromossômicas. O resultado final é uma metáfase e uma imagem de classificação cariótipo, no qual cada par de cromossomos tem uma cor distinta (Figura 2). Isso permite a fácil identificação de identidades cromossômicas e translocações. Para mais detalhes, visite o site da Imagem Aplicada (Spectral <a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a> ). SKY foi recentemente usada para a identificação de defeitos cromossômicos de segregação e anormalidades cromossômicas em humanos e camundongos com doença renal policística autossômica dominante (ADPKD), uma doença genética caracterizada por uma disfunção em cílios 11-13. Usando esta técnica, foi demonstrada a presença de segregação cromossômica anormal e defeitos cromossômicos em pacientes DPRAD e modelos de mouse 14. Outras análises usando SKY não só nos permitiu identificar o número cromossômico e identidade, mas também para detectar com precisão muito complexos aberrações cromossômicas, como translocações e deleções cromossômicas (Figura 2).

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Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Cariotipagem espectral (SKY) é uma técnica avançada citogenética para identificar as aberrações cromossômicas e cromossômicas. Essa técnica leva vantagem das sondas cromossômicas de pintura, que permitem a classificação de todos os cromossomos. SKY também pode identificar aberrações cromossômicas e defeitos complexos de segregação em camundongos e humanos, com várias doenças, incluindo doença renal policística.

Cariotipagem espectral para o Estudo de Anomalias cromossômicas em humanos e camundongos com doença renal policística

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Transplante ortotópico de aorta em camundongos para o Estudo da Doença Vascular

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Medicina

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th Nephrectomy em combinação com uma dieta alta de sal e Óxido Nítrico Sintase inibição para induzir o Doença Renal Crônica no Rato Lewis

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Avaliação da função vascular em pacientes com doença renal crônica

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Um Modelo Possível Zebrafish da doença renal policística: Knockdown de<em&gt; Wnt5a</em&gt; Faz com cistos no peixe-zebra Rins

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Adapting Human Videofluoroscopic Swallow Study Methods to Detect and Characterize Dysphagia in Murine Disease Models

Adaptação Humanos videofluoroscópicos Andorinha Métodos de Estudo de detectar e caracterizar Disfagia em modelos de doenças Murino

This study adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Usando vírus adeno-associado como uma ferramenta para o estudo da retina Barreiras na Doença

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Uso de ultra-alta MRI campo em pequeno roedor modelos de doença renal policística para<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotipagem and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Modelos cirúrgicos de refluxo gastroesofágico com Ratos

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Symmetric Bihemispheric Postmortem Cérebro de corte para o Estudo de Saúde e Condições Patológicas cerebral em humanos

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

Um modelo para simular hipóxia clinicamente relevantes em humanos

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...