Name: spectral karyotyping to study chromosome abnormalities in humans and mice with polycystic kidney disease
Uploaded: 2012-02-03T13:00:00
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Los autores desean agradecer a Brian Muntean, Lo Shao, Maki Takahashi y Mell Blair por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por concesiones del NIH (DK080640) y la Universidad de Toledo y ProMedica traslacional Premio Estímulo de Investigación con el Dr. Surya Nauli.

1. De la célula pre-tratamiento y preparación de la metafase <ol><li> Las células se cultivan en modif Dulbecco de Medio Eagle (DMEM) que contiene 10-15% de suero fetal bovino (SFB) y 1% penicilina / estreptomicina a 37 ° C con 5% de CO 2 incubadora, hasta que alcanzan 70-80% de confluencia. </li><li> Se tratan las células con solución colcemid a 0,05 ug / ml para 30-60 min. </li><li> Se recoge el medio que contiene las células flotantes en 50 ml tubos de centrífuga estériles de halcón. Lavar las ...

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	<li>Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+differentiation+along+metaphase+chromosomes.">Chemical differentiation along metaphase chromosomes.</a> Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).</li><li>Seabright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+banding+technique+for+human+chromosomes.">A rapid banding technique for human chromosomes.</a> Lancet. 2, 971-972 (1971).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).</li><li>Schrock, E., Zschieschang, P., O'Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+of+human,+mouse,+rat+and+ape+chromosomes--applications+for+genetic+diagnostics+and+research.">Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes--applications for genetic diagnostics and research.</a> Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumping+translocations+are+common+in+solid+tumor+cell+lines+and+result+in+recurrent+fusions+of+whole+chromosome+arms.">Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 30, 349-363 (2001).</li><li>Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+chromosome+abnormalities+in+haematological+malignancies+detected+by+multicolour+spectral+karyotyping.">Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping.</a> Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).</li><li>Karpf, A. R., Matsui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disruption+of+cytosine+DNA+methyltransferase+enzymes+induces+chromosomal+instability+in+human+cancer+cells.">Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells.</a> Cancer Research. 65, 8635-8639 (2005).</li><li>Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+spectral+karyotyping+to+the+analysis+of+the+human+chromosome+complement+of+interspecies+somatic+cell+hybrids.">Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids.</a> Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).</li><li>Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+genetic+complementation+controlling+the+chromosomal+abnormalities+and+loss+of+heterozygosity+formation+in+cancer.">A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer.</a> Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).</li><li>Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cytogenetics+revisited:+comparative+genomic+hybridization+and+spectral+karyotyping.">Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping.</a> Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany). 75, 801-814 (1997).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation Research. 104, 860-869 (2009).</li><li>Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystins+1+and+2+mediate+mechanosensation+in+the+primary+cilium+of+kidney+cells.">Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells.</a> Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).</li><li>Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cilia+are+fluid+shear+sensors+that+regulate+calcium+signaling+and+nitric+oxide+production+through+polycystin-1.">Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1.</a> Circulation. 117, 1161-1171 (2008).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+from+humans+and+mice+with+polycystic+kidney+disease+are+characterized+by+polyploidy+and+chromosome+segregation+defects+through+survivin+down-regulation.">Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation.</a> Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cytogenetic+analysis+of+the+bladder+carcinoma+cell+line+BK-10+by+spectral+karyotyping.">Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 25, 53-59 (1999).</li></ol>

Cariotipo espectral (SKY) es una técnica de citogenética utilizada en el estudio de las composiciones genómicas y cromosómicas. Esta técnica se aprovecha de las sondas de pintado cromosómico, y la detección de estas sondas son adquiridos a través de un interferómetro de Sagnac. El proceso de SKY completa generalmente toma alrededor de una semana, e implica varios pasos clave (Figura 1). El SKY utiliza un protocolo estándar, el cual fue descrito por primera vez por Padilla-Nash et al <...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro Mediatech Inc. </td><td> 10 a 013 CV </td><td></td></tr><tr><td> De suero fetal bovino (SFB) </td><td> Hyclone </td><td> SH30088-03 </td><td></td></tr><tr><td> Penecillin / estreptomicina </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Colcemid </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 295 892 001 </td><td> 10 g / ml </td></tr><tr><td> De HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S77375-1 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato solución salina tamponada </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256-01 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> SKY pintura Sonda (Humana) </td><td> Imágenes Applied Spectral </td><td> SKY000028 </td><td></td></tr><tr><td> SKY pintura Probe Kit (Mouse) </td><td> Imágenes Applied Spectral </td><td> SKY000030 </td><td></td></tr><tr><td> Concentrado kit de detección de anticuerpos </td><td> Imágenes Applied Spectral </td><td> SKY000033 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30236.01 </td><td></td></tr><tr><td> El metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A433P-4 </td><td></td></tr><tr><td> El ácido acético </td><td> Fisher Scientific </td><td> A38-212 </td><td></td></tr><tr><td> RNasa A </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 109 169 001 </td><td></td></tr><tr><td> Pepsina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6887-5G </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Fluka </td><td> 63069-500ML </td><td></td></tr><tr><td> 37% El formaldehído </td><td> Mallinckrodt Baker </td><td> 2106-02 </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20X </td><td> Promega </td><td> V4261 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida </td><td> Fluka </td><td> 47671 </td><td> preparar justo antes de usarse </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos de vidrio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio cubierta de vidrio 24x60mm </td><td> VWR Vista Vision </td><td> 16004-312 </td><td></td></tr><tr><td> Adhesivo de goma </td><td> Elmer (tienda local) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hibridación / humidifiedchamber / bandeja </td><td> Simport </td><td> M920-2 </td><td> poner las toallas de papel mojadas en la parte inferior </td></tr><tr><td> Thermociclista </td><td> Eppendorf </td><td> Epgradient S </td><td></td></tr><tr><td> Plataforma de agitación / Agitador orbital </td><td> Bellco Biotecnología </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Baño de agitación / agua </td><td> Precisión Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DAPI filtro de cubo </td><td> Chroma Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SKY filtro de cubo </td><td> Chroma Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SpectraCube </td><td> Imágenes Applied Spectral </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Celular microscopio invertido la cultura </td><td> Nikon </td><td> Nikon Eclipse TS100 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia </td><td> Olimpo </td><td> IX70 </td><td> Aceite de 60X </td></tr></tbody></table>

spectral karyotyping to study chromosome abnormalities in humans and mice with polycystic kidney disease

El método convencional para identificar y clasificar los cromosomas individuales depende del patrón único de bandas de cada cromosoma en una especie en particular se analizaron 1, 2. Esta técnica clásica anillamiento, sin embargo, no es fiable en la identificación de complejos aberraciones cromosómicas tales como aquellas asociadas con el cáncer. Para superar las limitaciones de la técnica de bandeo, cariotipo espectral (SKY) se introdujo para proporcionar mayor cantidad de información fiable sobre las anomalías cromosómicas. SKY es una fluorescencia multicolor de hibridación in situ (FISH) para detectar los cromosomas en metafase con el microscopio espectral de 3, 4. SKY ha sido demostrado ser una herramienta valiosa para el análisis citogenético de una amplia gama de anomalías cromosómicas asociadas con un gran número de enfermedades genéticas y enfermedades malignas 5, 6. CIELO implica el uso de sondas de ADN multicolores fluorescentemente-etiquetados preparados a partir de la oligonucleótidos degeneradoscebadores otide por PCR. Así, cada cromosoma tiene un color único espectral después de hibridación in situ con sondas, que están diferencialmente etiquetados con una mezcla de tintes fluorescentes (Rodamina, Texas Red, Cy5, FITC y Cy5.5). Las sondas utilizadas para SKY constar de hasta 55 sondas cromosómicas específicas 7-10. El procedimiento para SKY implica varios pasos (Figura 1). CIELO requiere la disponibilidad de células con alto índice mitótico a partir de tejido normal o enferma o sangre. Los cromosomas de una sola célula a partir de ya sea un celular recién aisladas primaria o una línea celular se extienden sobre un portaobjetos de vidrio. Esta propagación cromosoma está etiquetado con una combinación diferente de tintes fluorescentes específicas para cada cromosoma. Para la detección de la sonda y la adquisición de imágenes, el sistema de imagen espectral consta de interferómetro de Sagnac y una cámara CCD. Esto permite la medición del espectro de luz visible emitida desde la muestra y para adquirir una imagen espectral vaivénm individuales cromosomas. HiSKY, el software utilizado para analizar los resultados de las imágenes capturadas, proporciona una fácil identificación de anomalías cromosómicas. El resultado final es una metafase y una imagen de clasificación cariotipo, en el que cada par de cromosomas tiene un color distinto (Figura 2). Esto permite una fácil identificación de las identidades cromosoma y translocaciones. Para más información, visite el sitio web Aplicada Spectral Imaging ( <a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a> ). SKY se utilizó recientemente para la identificación de los defectos de la segregación cromosómica y las anomalías cromosómicas en humanos y ratones con autosómica dominante renal poliquística (PQRAD), una enfermedad genética que se caracteriza por una disfunción en los cilios primarios 11-13. Usando esta técnica, hemos demostrado la presencia de la segregación cromosómica anormal y anomalías cromosómicas en pacientes PQRAD y modelos de ratón 14. Los análisis adicionales utilizando SKY no sólo nos permitió identificar el número cromosómico y la identidad, sino también para detectar con precisión las aberraciones cromosómicas muy complejas, tales como deleciones y translocaciones cromosómicas (Figura 2).

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Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Cariotipo espectral (SKY) es una técnica de citogenética avanzada para identificar aberraciones genómicas y cromosómicas. Esta técnica se aprovecha de las sondas de pintado cromosómico, lo que permite la clasificación de todos los cromosomas. Sky también puede identificar aberraciones cromosómicas y defectos complejos de segregación en ratones y seres humanos con diversas enfermedades, incluyendo enfermedad renal poliquística.

Cariotipo espectral para el Estudio de anomalías cromosómicas en humanos y ratones con la enfermedad renal poliquística

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

El trasplante ortotópico aórtica en los ratones para el Estudio de la Enfermedad Vascular

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Investigación

Medicina

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th nefrectomía en combinación con dieta alta en sal y el óxido nítrico sintasa inhibición para inducir la enfermedad renal crónica en la rata Lewis

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Evaluación de la función vascular en pacientes con enfermedad renal crónica

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Un posible modelo de pez cebra de la enfermedad renal poliquística: Derribo de<em&gt; Wnt5a</em&gt; Causas Los quistes en el pez cebra Riñones

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Adapting Human Videofluoroscopic Swallow Study Methods to Detect and Characterize Dysphagia in Murine Disease Models

Adaptación videofluoroscópicos Swallow Métodos de Estudio Humanos para detectar y caracterizar disfagia en modelos murinos de enfermedades

This study adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Utilizando adeno-asociado virus como una herramienta para estudiar las barreras de retina en la enfermedad

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

El uso de ultra-alta MRI Field en Modelos pequeño roedor de la enfermedad renal poliquística para<em&gt; En Vivo</em&gt; Fenotipificación de Drogas y Vigilancia

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Modelos quirúrgicos de reflujo gastroesofágico con ratones

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Simétrica bihemisférica post-mortem del cerebro de corte para estudiar sana y patológica condiciones cerebrales en humanos

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

Un modelo para simular la hipoxia clínicamente relevantes en seres humanos

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...