Name: in vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis
Uploaded: 2012-02-17T13:00:00
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Wir möchten das Nikon Imaging Center an der Harvard Medical School, speziell Jennifer Waters, Lara und Wendy Petrak Lachs, für die Ausbildung und den Einsatz ihrer Zeitraffer Mikroskope danken. Wir möchten auch an Rosa Ng und Achim Besser für wertvolle Diskussionen danken. Diese Arbeit wurde vom NIH Grant 5695837 (an M. Iwanicki) und GM064346 zu GKI unterstützt; durch einen Zuschuss von Dr. Miriam und Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (bis GKI).

1. Eierstockkrebszelllinien Spheroid Formation <ol><li> RFP-exprimierenden Eierstockkrebs Zellen werden in 10% Base-Medium (ein benutzerdefiniertes Zellkulturmedium, das ein 50:50-Gemisch von 199 und MCDB105, 10% fötales Rinderserum und 1% Pen-Strep) kultiviert. Um RFP in unmarkierten Eierstockkrebs zu exprimieren, zu transfizieren der Zellen mit einem Plasmid, das RFP und wählen für Zellen RFP. Alternativ können virale Vektoren verwendet werden, um transient exprimieren fluoreszierende Proteine, oder Zellen könn...

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	<li>Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).</li><li>Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. , (2007).</li><li>Burleson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers.">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).</li><li>Birbeck, M. S., Wheatley, D. 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Biol. 29, 231-244 (2008).</li><li>Heyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesothelial+vitronectin+stimulates+migration+of+ovarian+cancer+cells.">Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells.</a> Cell. Biol. Int. 34, 493-502 .</li><li>Lessan, K., Aguiar, D. J., Oegema, T., Siebenson, L., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+and+beta1+integrin+mediate+ovarian+carcinoma+cell+adhesion+to+peritoneal+mesothelial+cells.">CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells.</a> Am. J. 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Int. 29, 482-488 (2005).</li><li>Leroy-Dudal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmigration+of+human+ovarian+adenocarcinoma+cells+through+endothelial+extracellular+matrix+involves+alphav+integrins+and+the+participation+of+MMP2.">Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2.</a> Int. J. Cancer. 114, 531-543 (2005).</li><li>Iwanicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium.">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).</li><li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+shape+in+growth+control.">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li><li>Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R. T., Lancaster, W. 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Metastasis. 12, 305-314 (1994).</li><li>Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+studying+heterotypic+cell-cell+interactions+and+tissue+specimen+cultures+under+controlled+microenvironments.">Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments.</a> Biomicrofluidics. 5, 13406-1310 (2011).</li><li>Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-extravasation+model+--+selection+of+highly+motile+and+metastatic+cancer+cells.">3D-extravasation model -- selection of highly motile and metastatic cancer cells.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 387-395 (2005).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930 (2003).</li><li>Dai, J., Ting-Beall, H. P., Hochmuth, R. M., Sheetz, M. P., Titus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+I+contributes+to+the+generation+of+resting+cortical+tension.">Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension.</a> Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).</li><li>Laferriere, J., Houle, F., Taher, M. M., Valerie, K., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transendothelial+migration+of+colon+carcinoma+cells+requires+expression+of+E-selectin+by+endothelial+cells+and+activation+of+stress-activated+protein+kinase-2+(SAPK2/p38)+in+the+tumor+cells.">Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 276, 33762-33772 (2001).</li><li>Dong, C., Slattery, M. J., Rank, B. M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+and+micromechanics+of+tumor+cell+chemotactic+protrusion,+locomotion,+and+extravasation.">In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation.</a> Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).</li></ol>

Der &quot;Ausverkauf Mesothelzellen Assay&quot; präsentiert hier verwendet Zeitraffer-Mikroskopie, um die Wechselwirkungen von Eierstockkrebs mehrzelligen Sphäroiden und Mesothelzellen Zellmonolayern überwachen, in der großen räumlichen und zeitlichen Detail. Zuvor hatten mehrere Gruppen 8-14 Endpunkt-Assays verwendet werden, um zu zeigen, dass Eierstock-Krebszellen zu befestigen und dringen in Mesothelzelle Monoschichten. Dieser Assay ist einzigartig, da sie verwendet fluoreszenzmarkierten Zellen Tumorz...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Zahl </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> OVCA433 Eierstockkrebszellen </td><td></td><td></td><td> Geschenk von Dr. Dennis Slamon </td></tr><tr><td> ZT Mesothelzellen </td><td></td><td></td><td> Geschenk von Dr. Tan Ince </td></tr><tr><td> Medium 199 </td><td> Gibco </td><td> 19950 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB105 </td><td> Cell-Anwendungen Inc. </td><td> 117-500 </td><td></td></tr><tr><td> FBS-hitzeinaktiviertem </td><td> Gibco </td><td> 10082 </td><td></td></tr><tr><td> Pen-Strep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Platten mit 96 Vertiefungen </td><td> Corning Costar </td><td> 3799 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Polyhydroxyethylmethacrylat (Poly-HEMA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 192066-25G </td><td> Für Poly-HEMA-Lösung aufzulösen 6 mg Poly-HEMA-Pulver in 1 ml 95% EtOH </td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 111ACS200 </td><td> Verdünnen Sie bis 95% in dH 2 0 </td></tr><tr><td> Zellkultur Haube </td><td> NuAire </td><td> NU-425-300 </td><td></td></tr><tr><td> Zellkultur-Inkubator </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> Inkubator für Poly-HEMA-Platten </td><td> Labline Instruments </td><td> Kaiserliche III 305 </td><td></td></tr><tr><td> Tischzentrifuge </td><td> Heraeus </td><td> 75003429/01 </td><td></td></tr><tr><td> 6 gut Glasboden-Schüssel </td><td> MatTek corp. </td><td> P06G-1.5-20-F </td><td></td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> Sigma </td><td> F1141-1MG </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21 bis 040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Zeitraffer-Mikroskop: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td> Ti-E Inverted Motorisierte Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskop mit integriertem Perfect Focus System </td></tr><tr><td> Objektiv </td><td> Nikon </td><td></td><td> 20X-0.75 numerische apeture </td></tr><tr><td> Halogen-Transilluminator </td><td> Nikon </td><td></td><td> 0,52 NA Kondensor für langen Arbeitsabstand </td></tr><tr><td> Anregungs-und Emissionsfilter </td><td> Chroma Single-Pass-Filter in Nikon-Gehäuse </td><td></td><td> GFP-Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 </td></tr><tr><td> Übertragen und Epifluoresce Lichtweg </td><td> Sutter </td&gt; <td></td><td> Smart-Fensterläden </td></tr><tr><td> Linear-kodierte Motortisch </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gekühlte Charged-Coupled Device-Kamera </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA-AG </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Inkubationskammer mit Temperatur und CO 2-Steuerung </td><td> custom-built </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schwingungsisolierung Tisch </td><td> TMC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS-Elements-Software </td><td> Nikon </td><td></td><td> Version 3 </td></tr></tbody></table>

in vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis

Eierstockkrebs ist die fünfte führende Ursache von Krebs verursachten Todesfälle in den Vereinigten Staaten ein. Trotz eines positiven ersten Reaktion auf Therapien, entwickeln 70 bis 90 Prozent der Frauen mit Eierstockkrebs neue Metastasen, und die Rezidivrate ist oft tödlich 2. Es ist daher notwendig, zu verstehen, wie sekundäre Metastasen entstehen, um bessere Behandlungen für Zwischen-und Spätstadium Eierstockkrebs entwickeln. Ovarialkarzinom Metastasen tritt auf, wenn bösartige Zellen aus dem Primärtumor Ort lösen und zu verbreiten, in der gesamten Bauchhöhle. Die disseminierten Zellen können vielzelligen Cluster oder Sphäroide, die entweder ungebunden bleiben wird, oder das Implantat auf Organe in der Bauchhöhle 3 (Abbildung 1, Movie 1) zu bilden. Alle Organe in der Bauchhöhle mit einem einzigen, kontinuierlichen, Schicht von Mesothelzellen 4-6 (2) ausgekleidet ist. Allerdings sind Mesothelzellen abwesend von untenPeritoneal Tumormassen, wie durch eine elektronenmikroskopische Aufnahme von Studien ausgeschnitten humanem Tumorgewebe Abschnitten 3,5-7 (2) offenbart. Dies deutet darauf hin, dass Mesothelzellen von der Unterseite der Tumormasse sind von einem unbekannten Prozess ausgeschlossen. Zurück in vitro Experimente zeigten, dass primäre Ovarialkarzinom Zellen effizienter zu befestigen extrazellulären Matrix, als Mesothelzellen 8, und neuere Studien zeigten, dass die primäre peritoneale Mesothelzellen tatsächlich eine Barriere für Eierstockkrebs Zelladhäsion und Invasion (im Gegensatz zu Adhäsion und Invasion im Vergleich auf Substraten, die nicht mit Mesothelzellen bedeckt waren) 9,10. Dies würde darauf hindeuten, dass Mesothelzellen als Barriere gegen Eierstock-Krebs Metastasen handeln. Die zellulären und molekularen Mechanismen, durch die Eierstockkrebszellen diese Barriere zu durchbrechen, und schließt die Mesothel haben bis vor kurzem unbekannt geblieben. Hier beschreiben wir the-Methodik für ein in-vitro-Test, dass die Modelle der Wechselwirkung zwischen Eierstockkrebszelllinien Sphäroide und Mesothelzellen in vivo (Abbildung 3, Movie 2). Unser Protokoll wurde von bisher beschriebenen Methoden zur Analyse Eierstocktumorzelllinien Interaktionen mit Mesothelzellen Monoschichten 16.8 angepasst, und wurde zum ersten Mal in einem Bericht zeigt, dass Eierstocktumorzellen verwenden einen Integrin-abhängige Aktivierung von Myosin und Zugkraft auf den Ausschluss von der Förderung beschrieben Mesothelzellen von unter einem Tumor Sphäroid 17. Dieses Modell nutzt die Vorteile der Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie, die beiden Zellpopulationen in Echtzeit zu überwachen und bietet räumliche und zeitliche Informationen über die Wechselwirkung. Die Eierstockkrebs exprimieren rot fluoreszierendes Protein (RFP), während die Mesothelzellen grün fluoreszierendes Protein (GFP). RFP-exprimierenden Eierstockkrebszelllinien Sphäroiden auf die GFP-exprimierenden Mesothelzellen Monoschicht zu befestigen. Die Sphäroide Verbreitung, einzudringen, undzwingen die Mesothelzellen beiseite schaffen ein Loch in der Monoschicht. Dieses Loch wird visualisiert als der negative Raum (schwarz) in der GFP-Bild. Die Fläche des Loches kann dann gemessen werden, um quantitativ die Unterschiede hinsichtlich des Clearance-Aktivität zwischen der Kontrolle und Populationen von Eierstockkrebs und / oder Mesothelzellen werden. Dieser Assay erfordert nur eine kleine Anzahl von Eierstockkrebszellen (100 Zellen pro Sphäroid x 20-30 Sphäroide pro Bedingung), so ist es möglich, diesen Assay unter Verwendung von wertvollen primären Tumorzelle Proben. Ferner kann dieser Assay einfach für Hochdurchsatz-Screening angepasst werden.

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In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Die Mesothelzellen-Clearance-Test hier beschriebenen nutzt die Vorteile der fluoreszenzmarkierten Zellen und Zeitraffer-Video-Mikroskopie zu visualisieren und quantitativ zu messen die Wechselwirkungen von Eierstockkrebs mehrzelligen Sphäroiden und Mesothelzelle Monoschichten. Dieser Test modelliert die frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs.

In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Experimental Metastasis Assay

Experimentelle Metastase Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Forschung

Medizin

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

MAME Modelle für die 4D-Bildgebung lebender Zellen von Tumor: Mikroumgebung Wechselwirkungen, die Einfluss auf maligne Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Multimodale Bildgebung von Angiogenese in einem Nude Rattenmodell der Brustkrebs Knochenmetastasen mittels Magnetresonanztomographie, volumetrische Computertomographie und Ultraschall

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Heterotypische Dreidimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellierung von Stromal-Epithelial Interaktionen beim Eierstockkrebs Initiation und Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Models of Bone Metastasis

Models von Knochenmetastasen

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

In vitro Anreicherung des Eierstockkrebs Tumor-initiierenden Zellen

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Die Quantifizierung von Intraperitonealtest Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...