Name: on-chip isotachophoresis for separation of ions and purification of nucleic acids
Uploaded: 2012-03-02T13:00:00
Duration: 10 min 32 s
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我々は感謝してDARPA主催のマイクロ/ナノ流体の基礎フォーカス（MF3）契約番号N66001-10-1-4003、下のセンターからDARPAの助成金N660001-09-C-2082からの資金調達を認める。

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	<li>Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+millionfold+sample+stacking+using+transient+isotachophoresis.">On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).</li><li>Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+100+am+fluorophores+using+a+high-sensitivity+on-chip+CE+system+and+transient+isotachophoresis.">Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).</li><li>Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. 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Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).</li><li>Bercovici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+urinary+tract+infections+using+isotachophoresis+and+molecular+beacons.">Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).</li><li>Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+malaria-infected+erythrocytes+using+isotachophoresis.">Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).</li><li>Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+electrolyte+chemistry+for+microfluidic+electrokinetics.+Part+I:+Acid-base+equilibria+and+pH+buffers.">Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers.</a> Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).</li><li>Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+dispersion+in+isotachophoresis.">Sample dispersion in isotachophoresis.</a> J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).</li><li>Kohlrausch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+concentrations-verschiebungen+durch+electrolyse+im+inneren+von+l&#214;sungen+und+l&#214;sungsgemischen.">&#220;ber concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von l&#214;sungen und l&#214;sungsgemischen.</a> Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).</li><li>Alberty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+boundary+systems+formed+by+weak+electrolytes.+Theory+of+simple+systems+formed+by+weak+acids+and+bases.">Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).</li><li>Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphasic+zone+electrophoresis.+I.+Steady-state+moving-boundary+systems+formed+by+different+electrolyte+combinations.">Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations.</a> Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).</li><li>Persat, A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+by+simultaneous+selective+isotachophoresis+and+hybridization+with+molecular+beacons.">MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons.</a> Anal. Chem. , (2011).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

ITP法は、迅速に敏感な、堅牢な検出およびイオン分子の処理を有効にするここで提示した。 ITPを使用する際の主な課題は、LEおよびTEバッファの適切な選択です。それは非常に高い絶対的な移動度を持つ強さの酸であるため、非常に予測可能な性質を持っているのでアニオンITPで、我々は一般的に主要な陰イオンとして塩化物を選択します。従って、アニオン性ITPのバッファの選択は、通常、適切なTEと対を選択することに低減されます。選択的な焦点の実験では、TEの選択は、汚染イオンの排除に重要です。汚染物質が存在しないアプリケーションでは、低TE実効移動度は、焦点の速い速度につながります。 MES、MOPS、HEPES、トリシン：我々は相対的にアニオン性のTEイオンを行儀には、次の手順を使用することをお勧めします。対イオンの選択は、システムのpHとTE効果的なモビリティの両方に影響を与えます。一般的な対イオンは、トリス（pKaは8.1）、ビス - トリス（pKaは6.4）です。低い、または高いpHを必要とするアッセイのために、我々はピリジン（pKaは5.25）をお勧めしそれぞれエタノールアミン（pKaは9.5）。 表1と表2に、アニオン性およびカチオン性ITPに対して、それぞれ、我々はいくつかの有用な緩衝液の例をまとめたものです。我々は、カチオン性LEイオン等のアニオン性LEイオンとナトリウムと塩酸を取り、我々はLEバッファー100 mMのイオン強度を想定しています。 読者は、私たちのプロトコルのバッファイオン強度（および表1-2）は、常により大きいまたは10 mMに等しいであることに注意します。理論的にITPの物理学が10mMより低いイオン強度で適用されますが、1 mMのレベルに近い自然な汚染物質（水や大気中の二酸化炭素との反応から、例えばカルボン酸）は、しばしば低イオン強度バッファーの実際の使用を制限します。 我々はシグナル伝達機構は、このプロトコルで提示アッセイに限定されないことに注意してください。パート5で簡単に説明したように、高原モードで精製したゾーンは、ローカル伝導率の変化は、UV absorを介して検出することができます屈折のbance、温度、またはインデックスです。私たち自身のグループでは、我々は、未知の分析対象物質の高感度な検出と識別のための蛍光灯のキャリアアンフォライトを利用する方法を開発しました。ピークモードの実験では図5に示すように 、特定のプローブが焦点を当てた分析対象物にラベルを付けるために使用することができます。高い特異性で標的DNAまたはRNA分子を検出するために11,18を -彼らの標的配列にハイブリダイゼーションの際に蛍光オリゴヌクレオチドプローブ-一実施例では、我々は、分子ビーコンを使用しています。 ITPは、圧力駆動流とEOFによって引き起こされる分散に対して比較的ロバストである一方で、過度のEOFは、平均EOFの速度がITPの速度に等しくなるITPインタフェースの停滞につながる可能性があります。14このような強力なEOFは、特に高pHの条件で発生します。と低イオン強度。このような理由から、我々は、pH 8以下で、便利な場合100mMのオーダーのイオン強度を持つバッファを使用することをお勧めします。我々の経験では、PVPはホウケイ酸塩チップのEOFを抑制するための最も効果的なコーティング。しかし、そのふるいの特性から、PVPは、このようなゲノムDNAを中心としていくつかのアプリケーション用の適切でないかもしれません。実験では、PVPの添加が大幅に（それは集中していませんポイントに）ゲノムDNAの絶対モビリティを減らすことができます観察します。これらのケースでは、界面活性剤（例えば、トリトンX-100）と、組み合わせてSigmacoteとしてシラノールコーティングはまた、EOFを減らすのに有効であること10 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TEアニオン（pKaは-1） </td></tr><tr><td> バッファ対イオン（PKA +1） </td><td> MES（6.10） </td><td> MOPS（7.20） </td><td> HEPES（7.50） </td><td> トリシン（8.15） </td></tr><tr><td>エタノールアミン（9.50） </td><td> 21.41 </td><td> 20.40 </td><td> 17.38 </td><td> 22.85 </td></tr><tr><td>トリス（8.08） </td><td> 21.00 </td><td> 19.23 &lt;/ TD&gt; <td> 15.84 </td><td> 17.56 </td></tr><tr><td>ビス - トリス（6.40） </td><td> 18.22 </td><td> 10.41 </td><td> 7.30 </td><td> 5.23 </td></tr><tr><td>ピリジン（5.18） </td><td> 1.01 </td><td> 3.72 </td><td> 2.42 </td><td> 1.48 </td></tr></tbody></table> 表1。 LEが100 mM HCl及び200mMの緩衝対イオンで ​​あるアニオン性のITPで調整された純粋な検体ゾーンの実効移動度の大きさ（×10 -9 M 2 / V / s）である。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TEの陽イオン（PKA +1） </td></tr><tr><td> バッファ対イオン（PKA -1） </td><td> エタノールアミン（9.50） </td><td> トリス（8.08） </td><td> ビス-トリス（6.40） </td><td> ピリジン（5.18） </td></tr><tr><td> MES（6.10） </td><td> 35.57 </td><td> 21.96 </td><td> 16.39 </td><td> 10.45 </td></tr><tr><td> MOPS（7.20） </td><td> 35.47 </td><td> 20.92 </td><td> 9.76 </td><td> 3.93 </td></tr><tr><td> HEPES（7.50） </td><td> 35.35 </td><td> 19.97 </td><td> 7.77 </td><td> 2.88 </td></tr><tr><td>トリシン（8.15） </td><td> 34.77 </td><td> 16.72 </td><td> 4.50 </td><td> 1.44 </td></tr></tbody></table> 表2。カチオン性ITPで調整された純粋な検体ゾーンの実効移動度の大きさ（×10 -9 M 2 / V / s）のLEは、100mM塩化ナトリウム、200 mMのバッファリングの対イオンで ​​ある。

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 試薬 </td></tr><tr><td> 名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>蒸留水</td><td> GIBCO </td><td> 10977 </td><td>アーゼ/ DNaseフリー</td></tr><tr><td>クロロックス超</td><td>クロロックス</td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム（NaOH） </td><td>マリンクロット</td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸（HCl） </td><td> EMDケミカルズ</td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma塩基（トリス） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン（PVP） </td><td>ポリサイエン株式会社</td><td> 06067 </td><td> MW100万</td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td>のAlexa Fluor 488カルボン酸</td><td>インビトロジェン</td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td>トリシン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td>ビス - トリス</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBRグリーンII </td><td>インビトロジェン</td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 411000 </td><td></td></tr><tr><td>ローダミン6G </td><td>アクロスオーガニック（ヘール、ベルギー） </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-アミノ酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> 電源のSYBR Green RNA-に-C T 1ステップキット </td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;TD&gt; PCRプライマー</td><td>統合されたDNAの技術</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 装置 </td></tr><tr><td> 名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ホウケイ酸塩マイクロ流体チップ</td><td>キャリパーライフサイエンス社</td><td> NS12A </td><td>プラスチックキャディーの有無にかかわらず未</td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>ガスト</td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td>ソースメータ</td><td>ケースレー</td><td> 2410 </td><td>定電流および定電圧動作モード</td></tr><tr><td>倒立落射蛍光顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> IX70 </td><td>照明用水銀ランプ（オリンパス）やLED（Thorlabs）を使用して、 </td></tr><tr><td>フィルターキューブ</td><td>オメガ</td><td> XF115-2 </td><td>励起/発光：ブルー/グリーン</td></tr><tr><td>安全なロックマイクロ遠心チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td> 022363204 </td><td> 1.5 mLの容量</td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> 表3。特異的試薬および装置。

on-chip isotachophoresis for separation of ions and purification of nucleic acids

電技術があるため可動部分のない、シンプルでコンパクトなシステムでは、流体および電気泳動プロセスのさまざまな操作を実行する独自の能力のマイクロアプリケーションの主食です。等速電気泳動（ITP）は、イオン移動度に基づいて百万倍濃縮1,2、および効率的な分離と抽出を実現することができ、シンプルで非常に堅牢な電テクニックです。たとえば、我々は分離と非標識の高感度検出にITPのアプリケーションを実証した3ほとんど、またはまったくサンプルの準備4月8日とし、細胞培養、尿、血液などの複雑なマトリックスからの核酸の抽出と精製にイオン分子（例えば、毒素、DNA、リボソームRNA、miRNAを）。9月12日 ITPは、焦点と流体チャネル·システム内に印加される電界と2つのバッファを用いて分離を実現しています。アニオン性の検体については、主要な電解質（LE）バッファが選ばれているその陰イオンとしてPersat らによって詳細に説明し、後続の電解質（TE）バッファー（実効移動度はイオンの観測ドリフト速度を説明し、アカウントへのイオンの電離状態をとり、の陰イオンよりも高い効果的な電気泳動移動度を持っているUCH 13）。 TEとLE間のインタフェースを確立した後、電界は、LEイオンはTEイオンが占有する領域から離れて移動するように適用されます。先にTEイオンの中間の効果的なモビリティのレースのサンプルイオンがLEイオンを追い越すので、それらはLE-TEインタフェース（以下、 &quot;ITPインターフェース&quot;と呼ばれる）でピント合わせはできません。さらに、TEとLEは、ITPのインタフェースで急な電場勾配を確立し、それぞれ低域と高導電性の領域を形成します。彼らは焦点としてこのフィールドの勾配は、サンプル種をpreconcentrates。適切な他の非焦点を当てた種から焦点を当て、対象種の精製におけるTEとLEの結果の選択と、最終的には、分離サンプル種のd分離。 ここではITPの基礎となる物理的な原則を確認し、2つの動作標準モードについて説明します。 &quot;ピーク&quot;と &quot;高原&quot;モード。ピークモードでは、比較的サンプルイオンがITPインターフェイスで狭いピークが重なっ内で一緒に焦点希釈します。高原モードでは、より豊富なサンプルイオンが定常状態の濃度に達するとその実効移動度順に並べられ、隣接する台地のようなゾーンに分離する。ピークと高原モードでは、同じ基礎となる物理学の外に発生するが、最初の分析対象成分の濃度および/またはサンプルの蓄積のために割り当てられた時間の量によって区別異なる制度を表しています。 我々は、最初に詳細にモデルのピークモードの実験を記述し、E.からの核酸の抽出のためのピークモードアッセイを実証する大腸菌の細胞培養。我々は分離を可視化するために、非焦点トレーサー（NFT）種を使用する場所、高原モードアッセイを提示することによって、単位および結論アミノ酸の定量を形成しています。

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On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

等速電気泳動（ITP）は、毒素の検出からサンプル調製に至るまでのアプリケーションで堅牢な電分離と濃縮技術です。小分子および細胞培養溶解液からの核酸の精製の分離と検出：我々はITPと2具体例のアプリケーションにこのテクニックを適用する方法論の物理的原理を確認します。

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