Name: on-chip isotachophoresis for separation of ions and purification of nucleic acids
Uploaded: 2012-03-02T13:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids at JoVE.com

Vi ønsker å takke for støtte fra DARPA sponset Micro / Nano lufthåndtering Fundamentals Focus (MF3) Center under kontrakt nummer N66001-10-1-4003, og fra DARPA stipend N660001-09-C-2082.

1. Fysikken ITP ITP danner en skarp bevegelig grense mellom ioner av som kostnad. Teknikken kan utføres med anioniske eller kationiske prøver, men vi skreddersyr denne introduksjon til anioniske ITP og merke de samme prinsippene gjelder for kationiske ITP. Vi velger LE og TE buffere slik at LE ionene har høyere magnitude effektiv elektroforetiske mobilitet. Den effektive elektroforetiske mobilitet, μ = U / E, er proporsjonalitetskonstanten mellom anvendt elektrisk felt, E, og ion drift hastighet, U. Tretten Vi etablerer en diffus grensesnitt mellom LE og TE og bruke et elektrisk felt rettet fra høy- konduktivitet LE sone til lav ledningsevne TE sone. Systemet etablerer raskt en sterk stigning i elektrisk felt ved ITP grensesnittet, på grunn av ikke-uniform ledningsevne profil. Som per navnet (fra gresk, «ISO&quot; betyr &quot;lik&quot;, &quot;takhos&quot; betyr &quot;speed&quot;), TE og LE ioner reise på samme, uniform velocity, som et resultat av den ikke-uniform elektrisk felt og bevaring av dagens (dette er den såkalte &quot;ITP tilstand&quot;, se figur 1). Den ITP Grensesnittet er selvslipende: LE ioner som diffus i TE sone oppleve en sterk gjenopprette flux og gå tilbake til den ledende sone (og vice versa for TE ioner i LE sone). Smak ioner fokus på dette grensesnittet dersom deres effektive mobilitet i TE sonen er større enn de av TE co-ioner, og hvis deres effektive mobilitet i LE sonen er mindre enn de LE co-ioner (se figur 1). Den selvslipende og fokusere egenskaper ITP bidrar til robusthet av denne teknikken og gjøre ITP relativt ufølsom for forstyrrelser av grensesnittet (for eksempel på grunn av press-drevet flow eller endringer i geometri, som sammentrekninger, utvidelser, og svinger). I topp-modus ITP (se figur 2a og videoer 1-2), sample ion konsentrasjonene ertil alle tider betydelig lavere enn LE og TE ion konsentrasjonen og dermed bidra ubetydelig til lokal ledningsevne. Fordelingen av prøven ioner bestemmes av selvslipende grensesnitt mellom naboland soner (her TE og LE) og verdien av utvalget effektiv mobilitet i forhold til disse sonene. 14. Flere eksempler ioner fokusere innenfor samme smale ITP grensesnitt region som i stor grad overlappende topper. Grensesnittet og peak bredder, samt tilhørende preconcentration faktor, skala omvendt med anvendt strømmen (se eksperimenter i Figur 2b) 14 For tilstrekkelig høye innledende prøven konsentrasjoner og tilstrekkelig akkumulering tid, sample ioner når en terskel konsentrasjon verdi. For fullt ioniserte arter, er denne verdien bestemmes av Kohlrausch foreskrivende funksjon (KRF). 15 For svake elektrolytter, er det bestemt av Alberty og Jovin funksjoner. 16,17 i Plateaumodus, som vist i Figur 3 og 3 Video, eksempler ioner skille og rense opp i soner med lokalt uniform og konstant konsentrasjon i en rekkefølge bestemt av deres effektiv mobilitet. Veldig fortynnede ioner kan fortsatt fokusere på topp modus mellom vidde soner. I ITP, kan eksempler ioner bli introdusert i en endelig injeksjon mellom TE og LE (se figur 3) eller vekselvis blandes sammen med TE og / eller LE (se figur 2). Vi viser til å blande i TE sone som &quot;semi-uendelig&quot; injeksjon, som kan brukes til å akkumulere analytten ioner kontinuerlig. Kontinuerlig prøve akkumulering øker følsomheten i både topp og platået modus analyser. Men endelig injeksjoner er mer vanlig i platå modus. Dette er trolig fordi høye innledende Analyttnedbryting konsentrasjoner i semi-uendelig injeksjon kan øke TE konduktivitet og lavere fokus priser. Dessuten er full rensing ikke mulig i semi-uendelig injeksjon (siden det remains et endelig konsentrasjon i TE). 2. Enhet renhold og klargjøring For analysene som presenteres i denne protokollen benytter vi isotropically våt-etset (omtrent D-formet tverrsnitt) glass microfluidic chips med et kryss-kanals design (se figur 1). Følgende rengjøring og klargjøring protokollen er optimalisert for borsilikat og smeltet silisiumdioksid kanaler, men kan også brukes med glass / PDMS chips. Utfør denne rengjøringsprosedyren før eksperimenter for å sikre kjøre-til-serie repeterbarhet og vellykket bruk av dynamiske belegg for å undertrykke electroosmotic flow (EOF). Utelatelse av denne protokollen kan resultere i sterk spredning av ITP grensesnittet. 14 <ol><li> Å dekontaminere kanalen, fyll Nord, Øst og Sør reservoarer med 10-20 mL av 10% blekemiddel og bruke vakuum i Vest-reservoaret i 2 min. Hvis du bruker en standard Caliper chip caddie, kan støvsugeren brukes effektivt ved å attaching den brede enden av en 200 mL (ufiltrert) pipettespiss til chip reservoar og koble vakuum linjen til en 2 mm indre diameter rør. </li><li> Tømme magasinene og skyll kanalen (som i trinn 1) med en M natriumhydroksid i 2 min. Dette etches forsiktig kanalen veggene, som gir en ren borsilikat overflate for å bidra til å etablere ensartet overflate egenskaper. </li><li> Tømme magasinene og ren med de-ionisert vann (DI), skyll kanalen med LE for ~ 2 min. I denne perioden overflateegenskaper og dynamiske belegg likevekt innenfor kanalen. </li></ol> 3. Fluoroforen fokus i topp modus ITP <ol><li> Forbered 1 mL LE bestående av 100 mm HCl, 200 mM Tris, og 1% PVP. </li><li> Forbered 1 mL TE bestående av 100 mm HEPES og 200 mM Tris. Kombiner 90 mL av TE med 10 mL av en mM Alexa Fluor 488 (AF488). </li><li> Etter skylling med LE som beskrevet i Del 2, tøm Vest-reservoaret og rengjør et par ganger med DI i ellerder for å fortynne eventuelle LE igjen i reservoaret. Fyll dette reservoaret med 20 mL TE inneholder AF488. </li><li> Plasser den positive elektroden i Øst-reservoaret og bakken (negativ) elektrode i Vest-reservoaret og påfør 2 μA (konstant strøm). Prøven topp vil migrere til en konstant hastighet fra Vest-reservoaret til Øst-reservoaret (se figur 1) og spenningen mellom disse reservoarene vil øke etter hvert som lavere ledningsevne TE fyller kanalen. </li></ol> 4. Utvinning og rensing av nukleinsyrer fra kultivert E. coli Evnen til å selektivt fokusere ioniske arter gjør ITP en ideell teknikk for biologisk prøveopparbeidelse. Vi renser nukleinsyrer fra ubehandlet celle lysate ved å velge en etterfølgende anion med en effektiv mobilitet størrelsesordener lavere enn målet nukleinsyre men høyere enn co-ioniske PCR-hemmere (f.eks anioniske vaskemidler, proteiner og organiske løsemidler, selv dersom den finnes i hiGH konsentrasjon). Kationiske PCR-hemmere (f.eks alkalimetaller og kationiske proteiner og vaskemidler) vandrer i motsatt retning, og så blir også liggende igjen. ITP ekstrakter og fokuserer målet nukleinsyrer fra prøven reservoaret, og samtidig la tregere PCR-hemmende arter bak (se figur 4). <ol><li> Skaff en prøve av eller kultur E. coli-celler til en tetthet større enn 10 8 CFU / ml. </li><li> Overfør 1 mL cellekultur i en safe-lås mikrosentrifuge tube og pellet ved sentrifugering ved 4000g i 6 min. </li><li> Re-suspendere pellet i 80 mL RNase-fritt vann og tilsett 10 mL av Lysing middel bestående av 10 mM tricine, 10 mM bis-tris, 2 mM EDTA, 0,1% Triton-X, og 5 mg / ml lysozym. Bland forsiktig og inkuberes i 5 minutter. ved romtemperatur (Lysing protokoll tilpasset fra Bercovici et al. 11). </li><li> Tilsett 10 mL av en M natriumhydroksid å heve lysate pH til ~ 12.5. Forsiktig betjene pipetten opp og ned tilløsningen blir klar, noe som medførte Lysing er fullført. </li><li> Kombiner 10 mL av lysate med 90 mL av 50 mM tricine og 100 mM bis-tris. Denne løsningen kan nå brukes som TE. </li><li> Forbered 1 mL LE bestående av 500 mm bis-tris, 250 mM HCl, 1% PVP, og 1X SYBR Green II. Fyll microfluidic chip med LE som beskrevet i Del 3. </li><li> For å trekke ut renset nukleinsyre for off-chip analyse etter ITP, erstatte innholdet i Øst-reservoaret med en PCR-kompatibel LE inneholder 50mm bis-tris, 25 mM HCl, og 0,1% PVP. Påfør 1000 V mellom øst og vest brønner for å starte eksperimentet. Den nåværende mellom disse reservoarene vil avta. </li><li> På slutten av forsøket prøven elutes i LE reservoaret. Sammenfallende med dette eluering, når den nåværende versus tid for dette systemet vanligvis et platå verdi (siden motstand er nå dominert av TE ioner jevnt fordelt innenfor kanal). Bland forsiktig i reservoaretInnholdet av gjentatt pipettering og trekke ut en 5 mL volum for analyse av kvantitativ RT-PCR. </li></ol> 5. Separasjon av aminosyrer med kationiske platå modus ITP og ikke-fokusering tracer (NFT) for visualisering ITP kan brukes til å skille og fokusere små ioner inn i tilstøtende og påvisbar platåer mellom TE og LE. Dette gjør påvisning og identifikasjon basert på fysiske egenskaper, for eksempel lokal konduktivitet, UV absorbans, temperatur sensing, eller brytningsindeksen. Her demonstrerer vi en ikke-fokus tracer (NFT) assay hvor en fluorescerende, co-ionisk arter legges til LE. Dette fluorescerende arten fokuserer ikke, men konsentrasjonen tilpasser seg en lokal elektrisk felt og dermed muliggjør visualisering av renset plateau soner (se figur 5). <ol><li> Forbered 1 mL LE bestående av 100 mm ethanolamine, 200 mm tricine, og 1% PVP, og 100 mM av kationiske fluoroforen Rhodamine 6G. </li> &lt;li&gt; Prepare 1 ml TE bestående av 20 mM Tris, 40 mm tricine. Forbered prøven ved å blande 90 mL av TE med 10 mL hver av 50 mM arginin og 50 mm lysin. </li><li> Tilsett 20 mL LE i vest og nord reservoarer og utvalget i Øst-reservoaret. Påfør vakuum ved Sør reservoaret i 1 min. </li><li> Skyll Øst godt med DI og erstatte med TE (TE uten sample). </li><li> Påfør 500 V mellom øst og vest reservoarer. </li></ol> 6. Representative Resultater Vi viser isotachopherograms av topp modus eksperimenter i Figur 2b og nukleinsyre utvinning eksperimenter i figur 4. I topp-modus eksperimenter med et fluorescerende reporter (f.eks AF488, SYBR Green II), kan den totale fluorescensintensiteten bli integrert og sammenlignet mot en kalibreringskurve å innhente kvantitativ konsentrasjon informasjon. Tolv tillegg, i nukleinsyre utvinning eksperimenter, er utvalget lov til å Eluer inn than LE reservoaret og ut med en pipette for analyse av kvantitativ RT-PCR. 10,12 Vi viser plateau modus isotachopherograms for aminosyre skille i figur 5. Fluorescensintensitet (i forhold til LE eller TE sone intensitet) kan brukes for sone identifikasjon, mens sone bredder aktivere kvantifisering. <img alt="Figur 1." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig1.jpg" /> Figur 1. Isotachophoresis (ITP) er en elektrokinetiske teknikk som brukes i microfluidic søknader for sensitiv deteksjon og separering av ioner. ITP har separasjon, selektiv fokusering, og preconcentration evner. I tillegg er det ekstremt robust og ufølsomt overfor fysiske forstyrrelser på grunn av sin selvslipende natur. Smak ioner selektivt fokus mellom en ledende (LE) og etterfølgende elektrolytt (TE) og reise gjennom microchannel med en konstant hastighet bestemmes av hastigheten på de ledende ioner i LE sone. Sample ionerfokusere hvis deres effektive elektroforetiske mobilitet er hakeparentesene med effektiv mobilitet av LE og TE ioner. Skjematisk viser en modell ITP eksperiment der utvalg fokuserer kontinuerlig mellom LE og TE soner. <img alt="Figur 2." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig2.jpg" /> Figur 2. Fortynn prøven ioner fokus på &quot;peak-modus&quot; ITP. a) To distinkt fortynnet (c prøve &lt;&lt; c LE) arter fokus i topp modus i grenseflaten dannet mellom LE og TE soner. Utelukkende LE og TE bestemme det elektriske feltet, som eksempler på arter ikke bidra vesentlig til strøm. Smak ioner er blandet med TE (i en semi-uendelig injeksjon) og fokusere sammen i en omtrent Gaussian topp på ITP grensesnittet. Fokusering kriteriet (vist som ulikheter) gjelder for sterkt ioniserte arter. b) Forsøk viser Alexa Fluor 488 (AF488) fokusert på topp modus for en rekke anvendt strømmer (se også Video 1). Eksempel peak bredde er omvendt proporsjonal med strømmen (for ubetydelig advective spredning grunn electroosmotic flyt). 14. selvslipende grensesnitt er motstandsdyktig mot spredning på grunn av press-drevet flow (se Video 2). <img alt="Figur 3." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig3.jpg" /> Figur 3. Eksempel ioner ved en tilstrekkelig høy konsentrasjon fokus på &quot;platået mode&quot; og styrer lokalt ledningsevne. Vi vanligvis introduserer prøven ioner i en endelig injeksjon mellom TE og LE. I denne modalitet, eksempler ioner atskilt og orden i henhold til deres effektiv elektroforetiske mobilitet (se bilde 3). For sterkt ioniserte arter, TE og platået sone konsentrasjoner bestemmes av Kohlrausch foreskrivende funksjon (KRF, en invariant sett opprinnelig med LE sone). Fortynnede ioner fortsette å fokusere på topp modus mellom platået soner bracketing deres effektiv mobilitet. Fokusering criterion (vist som ulikheter) gjelder for sterkt ioniserte arter. <img alt="Figur 4." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig4.jpg" /> Figur 4. Lysate forberedelse og nukleinsyre ekstraksjon med topp modus ITP. Nukleinsyre er hentet fra E. coli cellekultur hjelp lysozyme-assistert alkalisk Lysing og renset ved selektiv elektroforetiske fokusere via ITP. TE blandet med lysate (brun) inneholder mål nukleinsyre (grønn), proteiner, og potensielle PCR-hemmende kjemi. Passende utvalg av etterfølgende og ledende ioner muliggjør selektiv fokusering av målet nukleinsyre samtidig la PCR-hemmere bak. Totalt nukleinsyre ITP peak tar ofte på en ikke-ideell form, som vist her i innfelte bildet. Som en demonstrasjon av denne analysen, hentet vi total nukleinsyre fra gram-negative bakterier, Escherichia coli (lysert med natriumhydroksidløsning alene), renset NA fra lysate med ITP, samletden utpakkede genetisk materiale, og fremført QRT-PCR-analyser for å verifisere vellykket rensing av 16S rRNA (rød) og 16S rDNA (grønn) fra bakteriekultur. Negative kontroll terskelen sykluser for 16S rRNA (blå) og 16S rDNA (gul) var hver over 30 sykluser. Vi utførte QRT-PCR bruke strøm SYBR Grønn RNA-til-C T 1-Step Kit fra Applied Biosystems med 150 nM fremover (5&#39;-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) og revers (5&#39;-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) primere, ved de anbefalte termisk sykling forhold. <img alt="Figur 5." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig5.jpg" /> Figur 5. Non-fokusering tracer (NFT) assay for separasjon og deteksjon av umerkede aminosyrer. a) Skjematisk av NFT analysen. En endelig injeksjon av prøven ioner blir innført i Øst-kanalen. Vi blander LE med en tracer kationiske fluoroforen med effektiv mobilitet lavere enn TE ionene (μ tracer &lt;μ TE). Fluoroforensies å fungere som en &quot;underspeeding tracer&quot;. Som fluoroforen electromigrates fra LE i soner nå okkupert av prøven platåer og TE, opplever det en høyere elektrisk felt og dermed konsentrasjonen øker. Denne endringen i konsentrasjonen skaper trinn i isotachopherogram. b) Separering av to aminosyrer, arginin og lysin, ved hjelp av NFT analysen med Rhodamine 6G som underspeeding fluorescerende sporstoff. Den liten topp mellom TE og arginin er vanlig i ITP, er ikke godt forstått, og her forstyrrer ikke oppdager eller kvantifisere platåer. Supplemental Movie 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie1.mpg" target="_blank">Klikk her for å vise supplerende filmen</a> . Supplemental Movie 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie2.mpg" target="_blank">Klikk her for å vise supplerende filmen</a> . Supplemental Movie 3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie3.mpg" target="_blank">Klikk her for å vise supplerende filmen</a> .

<ol>
	<li>Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+millionfold+sample+stacking+using+transient+isotachophoresis.">On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).</li><li>Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+100+am+fluorophores+using+a+high-sensitivity+on-chip+CE+system+and+transient+isotachophoresis.">Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).</li><li>Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotachophoresis:+Theory,+instrumentation,+and+applications.">Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications.</a> Elsevier Science &#38; Technology. , (1976).</li><li>Khurana, T. K., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconcentration,+separation,+and+indirect+detection+of+nonfluorescent+analytes+using+fluorescent+mobility+markers.">Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers.</a> Anal. Chem. 80 (1), 279-279 (2008).</li><li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carrier+ampholytes+assay+for+portable,+label-free+detection+of+chemical+toxins+in+tap+water.">Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water.</a> Anal. Chem. 82 (5), 1858-1858 (2010).</li><li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+analyte+identification+using+isotachophoresis+and+a+fluorescent+carrier+ampholyte+assay.">Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay.</a> Anal. Chem. 82 (5), 2134-2134 (2010).</li><li>Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+system+for+isotachophoresis+assays.">Miniaturized system for isotachophoresis assays.</a> Lab Chip. 10 (17), 2242-2242 (2010).</li><li>Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+quantification+of+isotachophoresis+zones+using+nonfocusing+fluorescent+tracers.">Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers.</a> Anal. Chem. 81 (8), 3022-3022 (2009).</li><li>Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+extraction,+isolation,+preconcentration,+and+quantitation+of+small+RNAs+from+cell+lysate+using+on-chip+isotachophoresis.">Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis.</a> Lab Chip. 9 (15), 2145-2145 (2009).</li><li>Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+nucleic+acids+from+whole+blood+using+isotachophoresis.">Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).</li><li>Bercovici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+urinary+tract+infections+using+isotachophoresis+and+molecular+beacons.">Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).</li><li>Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+malaria-infected+erythrocytes+using+isotachophoresis.">Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).</li><li>Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+electrolyte+chemistry+for+microfluidic+electrokinetics.+Part+I:+Acid-base+equilibria+and+pH+buffers.">Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers.</a> Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).</li><li>Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+dispersion+in+isotachophoresis.">Sample dispersion in isotachophoresis.</a> J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).</li><li>Kohlrausch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+concentrations-verschiebungen+durch+electrolyse+im+inneren+von+l&#214;sungen+und+l&#214;sungsgemischen.">&#220;ber concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von l&#214;sungen und l&#214;sungsgemischen.</a> Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).</li><li>Alberty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+boundary+systems+formed+by+weak+electrolytes.+Theory+of+simple+systems+formed+by+weak+acids+and+bases.">Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).</li><li>Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphasic+zone+electrophoresis.+I.+Steady-state+moving-boundary+systems+formed+by+different+electrolyte+combinations.">Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations.</a> Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).</li><li>Persat, A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+by+simultaneous+selective+isotachophoresis+and+hybridization+with+molecular+beacons.">MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons.</a> Anal. Chem. , (2011).</li></ol>

Vi har ingenting å avsløre.

De ITP metodene som presenteres her muliggjøre rask, følsom, og robust deteksjon og håndtering av ioniske molekyler. Hovedutfordringen i bruk ITP er riktig valg av LE og TE buffere. I anioniske ITP, vi vanligvis velger klorid som den ledende anionet fordi det er en sterk syre med svært høy absolutt mobilitet og dermed har svært forutsigbare egenskaper. Derfor er buffer valg i anioniske ITP typisk redusert til å velge en riktig TE og counterion. For selektive fokus eksperimenter, er TE valg kritisk til utelukkelse av forurensende ioner. I applikasjoner der forurensninger ikke er til stede, fører lavere TE effektiv mobilitet til raskere å fokusere. Vi anbefaler å bruke følgende, relativt veloppdragen anioniske TE ioner: MES, mopper, HEPES og tricine. Valg av counterion påvirker både system pH og TE effektiv mobilitet. Vanlige counterions er tris (pKa 8,1) og bis-tris (pKa 6,4). For analyser som krever lavere eller høyere pH, anbefaler vi pyridine (pKa 5,25) ogethanolamine (pKa 9,5), henholdsvis. I tabell 1 og 2, for anioniske og kationiske ITP, henholdsvis oppsummere vi flere nyttige buffer eksempler. Vi tar HCl som den anioniske LE ion og natrium som det kationiske LE ion, og vi antar 100 mm ionisk styrke LE buffer. Leseren vil merke at bufferen ionisk styrke i våre protokoller (og i tabell 1-2) er alltid større enn eller lik 10 mm. Mens i teorien fysikken i ITP gjelder på ionisk styrke lavere enn 10 mm, naturlige forurensninger (f.eks karbonsyre fra reaksjon mellom vann og atmosfærisk karbondioksid) i nærheten av en mM nivået ofte begrenser den praktiske bruken av lave ioniske styrke buffere. Vi registrerer at signaltransduksjon mekanismen ikke er begrenset til de analysene som presenteres i denne protokollen. Som omtalt kort i del 5, i platå modus renset soner kan oppdages via endringer i lokal konduktivitet, UV absorbance, temperatur, eller brytningsindeksen. I vår egen gruppe, har vi utviklet en metode som benytter lysstoffrør carrier ampholytes for sensitiv påvisning og identifikasjon av ukjente analytter. 5. I peak-modus eksperimenter, kan spesifikke prober brukes til å merke fokuserte analytter. I ett eksempel, bruker vi molekylære beacons - oligonukleotid sonder som fluoresce ved hybridisering til målet rekkefølge - for å oppdage mål DNA eller RNA-molekyler med høy spesifisitet 11,18. Mens ITP er relativt robust mot spredning forårsaket av press-drevet flyt og EOF, kan overdreven EOF føre til stagnasjon av ITP grensesnittet, hvor gjennomsnittlig EOF hastigheten blir lik den ITP hastigheten. 14 slike sterke EOF oppstår spesielt under forhold med høy pH og lav ionisk styrke. Av denne grunn anbefaler vi bruk av buffere med pH 8 eller lavere og med ionisk styrke på størrelsesorden 100 mm dersom praktisk. Vår erfaring er PVP denmest effektive belegg for EOF undertrykkelse i borsilikat chips. Men på grunn av dens sikting egenskaper, kan PVP ikke være hensiktsmessig for enkelte programmer, for eksempel fokusere genomisk DNA. I eksperimenter, observerer vi at tillegg av PVP kan sterkt redusere genomisk DNA absolutt mobilitet (til et punkt der det ikke fokus). I disse tilfellene en silanol belegg som Sigmacote i conjuction med en tensidet (f.eks Triton-X 100) kan også være effektive i å redusere EOF. Ti <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE anion (pKa -1) </td></tr><tr><td> Bufring counterion (pKa +1) </td><td> MES (6.10) </td><td> MOPS (7,20) </td><td> HEPES (7.50) </td><td> tricine (8,15) </td></tr><tr><td> ethanolamine (9,50) </td><td> 21.41 </td><td> 20.40 </td><td> 17.38 </td><td> 22.85 </td></tr><tr><td> tris (8,08) </td><td> 21.00 </td><td> 19.23 &lt;/ Td&gt; <td> 15.84 </td><td> 17.56 </td></tr><tr><td> bis-tris (6,40) </td><td> 18.22 </td><td> 10.41 </td><td> 7,30 </td><td> 5,23 </td></tr><tr><td> pyridine (5,18) </td><td> 1,01 </td><td> 3,72 </td><td> 2,42 </td><td> 1,48 </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Effektiv mobilitet magnitude (× 10 -9 m 2 / V / s) av justert ren analytt sone i anioniske ITP der LE er 100 mm HCl og 200 mm buffering counterion. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE kasjon (pKa +1) </td></tr><tr><td> Bufring counterion (pKa -1) </td><td> ethanolamine (9,50) </td><td> tris (8,08) </td><td> bis-tris (6,40) </td><td> pyridine (5,18) </td></tr><tr><td> MES (6.10) </td><td> 35.57 </td><td> 21.96 </td><td> 16.39 </td><td> 10.45 </td></tr><tr><td> MOPS (7,20) </td><td> 35.47 </td><td> 20.92 </td><td> 9,76 </td><td> 3,93 </td></tr><tr><td> HEPES (7.50) </td><td> 35.35 </td><td> 19.97 </td><td> 7,77 </td><td> 2,88 </td></tr><tr><td> Tricine (8,15) </td><td> 34.77 </td><td> 16.72 </td><td> 4,50 </td><td> 1,44 </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Effektiv mobilitet magnitude (× 10 -9 m 2 / V / s) av justert ren analytt sone i kationiske ITP der LE er 100 mm natrium og 200 mm buffering counterion.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> REAGENSER </td></tr><tr><td> Navn </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Destillert vann </td><td> GIBCO </td><td> 10977 </td><td> RNase / DNase gratis </td></tr><tr><td> Clorox Ultra </td><td> Clorox </td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td> natriumhydroksid (NaOH) </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td> saltsyre (HCl) </td><td> EMD Kjemikalier </td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma base (tris) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidone (PVP) </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 06067 </td><td> MW millioner </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 karboksylsyre </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> tricine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td> bis-Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> lysozyme </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Grønn II </td><td> Invitrogen </td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td> ethanolamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 411000 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine 6G </td><td> ACROS Organics (Geel, Belgia) </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-aminosyrer </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> Strøm SYBR Grønn RNA-til-C T 1-Step Kit </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; PCR primere </td><td> Integrert DNA Technologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> UTSTYR </td></tr><tr><td> Navn </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Borsilikat microfluidic chip </td><td> Caliper Life Sciences Inc. </td><td> NS12A </td><td> Leveres med eller uten plast caddie </td></tr><tr><td> Vakuumpumpe </td><td> Gast </td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td> Sourcemeter </td><td> Keithley </td><td> 2410 </td><td> Konstant strøm og konstant spenning operasjonsmodi </td></tr><tr><td> Inverted epifluorescent mikroskop </td><td> Olympus </td><td> IX70 </td><td> Bruk kvikksølv lampe (Olympus) eller LED (Thorlabs) for belysning </td></tr><tr><td> Filter kube </td><td> Omega </td><td> XF115-2 </td><td> Eksitasjon / utslipp: blå / grønn </td></tr><tr><td> Sikker-Lås Mikrosentrifugerør </td><td> Eppendorf </td><td> 022363204 </td><td> 1,5 ml kapasitet </td></tr><tr><td> Sentrifuger </td><td> Eppendorf </td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 3. Spesifikke reagenser og utstyr.

on-chip isotachophoresis for separation of ions and purification of nucleic acids

Elektrokinetiske teknikker er et fast innslag i mikroskala søknader på grunn av sin unike evne til å utføre en rekke fluidic og elektroforetiske prosesser i enkle, kompakte systemer med ingen bevegelige deler. Isotachophoresis (ITP) er en enkel og meget robust elektrokinetiske teknikk som kan oppnå millioner ganger preconcentration 1,2 og effektiv separasjon og utvinning basert på ionisk mobilitet. 3 For eksempel har vi demonstrert bruken av ITP til separasjon og sensitiv påvisning av umerket ioniske molekyler (f.eks giftstoffer, DNA, rRNA, Mirna) med liten eller ingen prøveopparbeidelse 4-8 og til utvinning og rensing av nukleinsyrer fra komplekse matriser inkludert cellekultur, urin og blod. 9-12 ITP oppnår fokus og separasjon ved hjelp av en anvendt elektrisk felt og to buffere i en fluidic kanal system. For anioniske analytter, er den ledende elektrolytt (LE) buffer valgt sUCH at dets anioner har høyere effektiv elektroforetiske mobilitet enn anioner av etterfølgende elektrolytt (TE) buffer (Effektiv mobilitet beskriver den observerbare drift hastigheten til et ion og tar hensyn til ionisering tilstand ion, som beskrevet i detalj av Persat et al 13.). Etter etablering av et grensesnitt mellom TE og LE er et elektrisk felt anvendt slik at LE ioner bevege seg bort fra området okkupert av TE ioner. Smak ioner av mellomliggende effektiv mobilitet rase foran TE ioner, men kan ikke kjøre forbi LE ioner, og så fokuserer de på LE-TE-grensesnitt (heretter kalt &quot;ITP interface&quot;). Videre TE og LE form regionene henholdsvis lav og høy ledningsevne, som etablerer en bratt elektrisk felt gradient på ITP grensesnittet. Dette feltet gradient preconcentrates prøve arter som de fokuserer. Riktig valg av TE og LE resultater i fokus og rensing av målarter fra andre ikke-fokuserte arter og, til slutt, separasjon end segregering av prøven arter. Vi her gjennomgå de fysiske prinsipper som ligger til grunn ITP og diskutere to standard driftsmoduser: &quot;peak&quot; og &quot;Plateau&quot; moduser. I topp-modus, forholdsvis tynn sample ioner fokusere sammen innenfor overlappende trange topper på ITP grensesnittet. I platå modus, mer rikelig utvalg ioner nå en steady-state konsentrasjon og segregere inn tilstøtende platå-lignende soner sortert etter deres effektiv mobilitet. Peak og platå moduser oppstå ut av de samme underliggende fysikken, men representerer forskjellige regimer differensiert etter den innledende analyttkonsentrasjon og / eller hvor mye tid avsatt til prøven akkumulasjon. Vi først beskrive i detalj en modell topp modus eksperiment, og deretter demonstrere en topp modus analysen for utvinning av nukleinsyrer fra E. coli cellekultur. Vi konkluderer med å presentere et platå modus analysen, hvor vi bruker en ikke-fokus tracer (NFT) arter for å visualisere separasjon og perdanne kvantifisering av aminosyrer.

Watch this Scientific Journal Video about On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids at JoVE.com

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Isotachophoresis (ITP) er en robust elektrokinetiske separasjon og preconcentration teknikk med applikasjoner som spenner fra toksin påvisning til prøveopparbeidelse. Vi gjennomgår de fysiske prinsippene for ITP og metodikk for å bruke denne teknikken til to spesifikke eksempel søknader: separasjon og deteksjon av små molekyler og rensing av nukleinsyrer fra cellekultur lysate.

On-chip Isotachophoresis for Separasjon av ioner og rensing av nukleinsyrer

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Bioengineering

Unit 1

Current and Resistance

SCIENTISTS IN ACTION

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Lensfree On-chip tomographic Mikroskopi Ansette Multi-angle Belysning og Pixel Super-oppløsning

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Expression, Isolation, og Rensing av løselig og uløselig Biotinylated Proteiner for nervevev Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Syntese av hydrogeler med Bunn Egenskaper som membraner for vannrensing

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Tørr Film Photoresist-baserte elektrokjemisk Microfluidic Biosensor plattform: Enheten fabrikasjon, på prosessoren analysen forberedelser og systemdriften

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Fabrikasjon og validering av en Organ-on-chip System med integrerte elektrodene direkte kvantifisere Transendothelial elektrisk motstand

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Visuell gjenkjenning av flere nukleinsyrer i kapillær arrayet

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Forberedelse, rensing og bruk av fettsyrer inneholder liposomer

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Antimikrobielle peptider produseres av seleksjonspress innlemmelse av ikke-kanoniske aminosyrer

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...