Name: on-chip isotachophoresis for separation of ions and purification of nucleic acids
Uploaded: 2012-03-02T13:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids at JoVE.com

Vi erkänner tacksamt medel från DARPA sponsrade Micro / Nano Fluidics Fundamentals Focus (MF3) Center under avtalsnummer N66001-10-1-4003, och från DARPA bidrag N660001-09-C-2082.

1. Fysik ITP ITP bildar en skarp rörelse gräns mellan joner med lika laddning. Tekniken kan utföras med anjoniska eller katjoniska prover, men vi skräddarsyr denna introduktion på anjoniska ITP och notera samma principer gäller för katjoniska ITP. Vi väljer LE och TE buffertar så att LE joner har högre magnitud effektivt elektroforetisk rörlighet. Den effektiva elektroforetiska mobiliteten, μ = U / E, är proportionalitetskonstanten mellan pålagt elektriskt fält, E och jon drifthastighet, U. 13 Vi etablera en diffus gränssnitt mellan LE och TE och anbringa ett elektriskt fält som är riktad från hög- ledningsförmåga LE zonen till låg ledningsförmåga TE zon. Systemet skapar snabbt en stark gradient i elektriskt fält vid ITP-gränssnittet, på grund av ojämn ledningsförmåga profil. Enligt dess namn (från grekiska &quot;isos&quot; betyder &quot;lika&quot;, &quot;takhos&quot; betyder &quot;speed&quot;), TE och LE joner resor på samma enhetliga velocity, som ett resultat av den icke-homogent elektriskt fält och bevarande av ström (detta är den så kallade &quot;ITP tillstånd&quot;, se figur 1). ITP-gränssnittet är självskärpande: LE joner som diffunderar in TE zonen uppleva en stark återställande flöde och återgå till den ledande zonen (och vice versa för TE joner i LE zonen). Provjonerna fokusera vid denna gränsyta, om deras effektiva rörlighet i TE zonen är större än de för de TE co-joner, och om deras effektiva rörlighet i LE zon är mindre än den för de LE co-joner (se figur 1). Den självskärpande och fokusera egenskaper ITP bidrar till stabilitet av denna teknik och göra ITP relativt okänslig för störningar i gränssnittet (t.ex. på grund av tryck-driven flöde eller förändringar i geometri, som sammandragningar, expansioner och varv). I topp-läget ITP (se figur 2a och videor 1-2), prov jon koncentrationeralltid betydligt lägre än LE och TE jonkoncentrationer och därmed bidra försumbart till lokal ledningsförmåga. Fördelningen av prov joner bestäms av självskärpande gränssnitt mellan närbelägna zonerna (här TE och LE) och värdet för provet effektiv rörlighet i förhållande till dessa zoner. 14 Flera provjonerna fokusera inom samma smala ITP gränsområdet som till stor del överlappande toppar. Gränssnittet och topp bredder samt tillhörande förkoncentrering faktorn, skala omvänt med den tillämpade ström (se experiment i figur 2b) 14. För tillräckligt höga initiala koncentrationen i proverna och tillräcklig ansamling tid, provjonerna nå ett tröskelvärde koncentration. För helt joniserade arter är detta värde bestäms av Kohlrausch reglerande funktion (KRF) 15. För svaga elektrolyter, det bestäms av Alberty och Jovin funktioner. 16,17 i Plateauläge, såsom visas i fig 3 och video 3, provjonerna separera och rena i zoner av lokalt likformig och konstant koncentration i en ordning som bestäms av deras effektiva rörlighet. Mycket utspädda joner kan fortfarande fokusera på topp läge mellan platån zoner. I ITP kan provjonerna införas i en ändlig injektion mellan TE och LE (se figur 3) eller alternativt blandas tillsammans med TE-och / eller LE (se figur 2). Vi hänvisar till blandning i TE zonen som &quot;semiinfinit&quot; injektion, som kan användas för att ackumulera analyt-joner kontinuerligt. Kontinuerlig prov ackumulering ökar känsligheten i både topp och platå analyser läge. Men ändliga injektioner är vanligare i Plateau läge. Detta är sannolikt eftersom höga initiala analytkoncentrationer i semiinfinit injektion kan avsevärt öka TE ledningsförmåga och lägre fokus priser. Dessutom är fullständig rening omöjligt i semiinfinit injektion (eftersom det remains en begränsad koncentration i TE). 2. Device rengöring och förberedelse För analyserna presenteras i detta protokoll använder vi isotropiskt våt-etsad (ungefär D-format tvärsnitt) glas mikroflödessystem chips med ett kryss-kanal design (se figur 1). Följande rengöring och förberedelse protokollet är optimerad för borosilikatglas och smält kiseldioxid kanaler, men kan även användas med glas / PDMS chips. Utför denna rengöring som gällde före experiment för att se till att köra till driva repeterbarhet och framgångsrik tillämpning av dynamiska beläggningar som behövs för att undertrycka elektroosmotiskt flöde (EOF). Utelämnande av detta protokoll kan resultera i stark spridning av ITP-gränssnittet 14. <ol><li> Att sanera kanalen, fyll i norr, öst och söder reservoarer med 10-20 pl 10% blekmedel och tillämpa vakuum vid Västra reservoaren för 2 min. Om du använder en vanlig Caliper chip caddie, kan vakuum tillämpas effektivt genom att helt enkelt attaching den breda änden av en 200 | il (ofiltrerade) pipettspets till chipet reservoaren och anslutningsmediet vakuumledningen till en 2 mm inre diameter. </li><li> Tömma behållare och skölj-kanalen (som i steg 1) med 1 M natriumhydroxid under 2 min. Detta etsar försiktigt kanalväggarna, vilket ger en ren borsilikat yta bidra till att skapa enhetliga ytegenskaper. </li><li> Töm behållarna och rengör med avjoniserat vatten (DI), skölj sedan kanalen med LE för ~ 2 min. Under denna period ytegenskaper och dynamiska beläggningar jämvikta i kanalen. </li></ol> 3. Fluorofor fokus i topp läget ITP <ol><li> Framställ 1 ml LE bestående av 100 mM HCl, 200 mM tris, och 1% PVP. </li><li> Framställ 1 ml TE bestående av 100 mM HEPES och 200 mM tris. Kombinera 90 pl TE med 10 pl av 1 | iM Alexa Fluor 488 (AF488). </li><li> Efter sköljning med LE som beskrivs i del 2, töm väst behållaren och rengör ett par gånger med DI i ellerder för att späda varje LE kvar i reservoaren. Fyll denna reservoar med 20 pl TE innehållande AF488. </li><li> Placera den positiva elektroden i öst reservoaren och jord (negativ) elektrod i väst behållaren och använda 2 ^ A (konstant ström). Provet toppen kommer att migrera med konstant hastighet från väst reservoaren till öst behållaren (se figur 1) och spänningen mellan dessa reservoarer kommer att öka som den lägre ledningsförmåga TE fyller kanalen. </li></ol> 4. Extraktion och rening av nukleinsyror från odlade E. coli Förmågan att selektivt koncentrera jonslag gör ITP en idealisk teknik för biologisk provberedning. Vi rena nukleinsyror från obehandlade cellysat genom att välja en bakre anjon med en effektiv mobilitet storleksordning lägre än den sökta nukleinsyran men högre än co-joniska PCR-inhibitorer (t.ex. anjoniska detergenter, proteiner och organiska lösningsmedel, även om den finns i hiGH-koncentration). Katjonisk PCR-hämmare (t.ex. alkalimetaller och katjoniska proteiner och rengöringsmedel) migrerar i motsatt riktning och är så även kvar. ITP utvinner och fokuserar målnukleinsyror från provet behållaren, medan långsammare PCR-hämmande arter bakom (se figur 4). <ol><li> Skaffa ett urval av eller kultur E. coli-celler till en densitet större än 10 8 CFU / ml. </li><li> Överföra en kultur ml cellen in i en säker-lås mikrocentrifugrör och pelleten genom centrifugering vid 4000g under 6 min. </li><li> Återsuspendera pelleten i 80 | il RNas-fritt vatten och tillsätt 10 | il av lyseringsmedel bestående av 10 mM tricin, 10 mM bis-tris, 2 mM EDTA, 0,1% Triton-X och 5 mg / ml lysozym. Blanda försiktigt och inkubera i 5 minuter. vid rumstemperatur (lysering protokoll anpassad från Bercovici et al. 11). </li><li> Tillsätt 10 pl av 1 M natriumhydroxid för att höja pH-lysatet till ~ 12,5. Försiktigt manövrera pipetten upp och ner tillslösningen blir klar, vid vilken punkt lyserande är fullbordad. </li><li> Kombinera 10 pl av lysat med 90 | il av 50 mM tricin och 100 mM Bis-Tris. Denna lösning kan nu användas som TE. </li><li> Framställ 1 ml LE bestående av 500 mM Bis-Tris, 250 mM HCl, 1% PVP och 1X SYBR Green II. Fyll mikroflödessystem chip med LE som beskrivs i del 3. </li><li> För att extrahera den renade nukleinsyran för off-chip-analys efter ITP ersätta innehållet i öst reservoaren med en PCR-kompatibel LE innehållande 50 mM bis-tris, 25 mM HCl och 0,1% PVP. Applicera 1000 V mellan öst och väst brunnar för att påbörja experimentet. Strömmen mellan dessa reservoarer kommer att minska. </li><li> Vid slutet av experimentet provet elueras i LE reservoaren. Samtidigt med detta eluering når aktuell mot tiden för detta system normalt ett platåvärde (eftersom motståndet nu domineras av TE joner jämnt fördelade i kanalen). Blanda försiktigt reservoarenInnehållet genom upprepad pipettering och extrahera en 5 | il volym för analys med kvantitativ RT-PCR. </li></ol> 5. Separation av aminosyror med katjonisk platå läge ITP och icke-fokus spårämne (NFT) för visualisering ITP kan användas för att separera och fokusera små joner i angränsande och detekterbart platåer mellan TE och LE. Detta medger detektering och identifiering baserad på fysikalisk-kemiska egenskaper, såsom lokal konduktivitet, UV-absorbans, temperaturavkänning, eller brytningsindex. Här visar vi en icke-fokus spårämne (NFT)-analys, där en fluorescerande, co-jonisk species tillsätts till LE. Detta fluorescerande arter fokuserar inte, men dess koncentration anpassar sig till en lokal elektriskt fält och därmed möjliggör visualisering av renade platå zoner (se figur 5). <ol><li> Framställ 1 ml LE bestående av 100 mM etanolamin, 200 mM tricin, och 1% PVP och 100 | iM av den katjoniska fluoroforen Rhodamine 6G. </li> &lt;li&gt; bereda 1 ml TE bestående av 20 mM tris, 40 mM tricin. Framställa prov genom att blanda 90 ^ il TE med 10 | il vardera av 50 mM arginin och 50 mM lysin. </li><li> Fördela 20 pl LE i Västra och Norra reservoarer och provsmaka i öst reservoaren. Applicera vakuum vid Södra reservoar för 1 min. </li><li> Skölj öst väl med DI och ersätt med TE (TE utan prov). </li><li> Applicera 500 V mellan öst och väst reservoarer. </li></ol> 6. Representativa resultat Vi visar isotachopherograms av toppmoden experiment i figur 2b och nukleinsyrasekvenser experiment extraktion i figur 4. I toppmoden experiment med en fluorescerande reporter (t ex AF488, SYBR Green II), kan den totala fluorescensintensiteten integreras och jämförs med en kalibreringskurva för att erhålla kvantitativ information om koncentration. 12 Dessutom, i nuklein experiment syraextraktion, är provet fick avge in than LE reservoar och extraherades med en pipett för analys med kvantitativ RT-PCR. 10,12 Vi visar isotachopherograms platå läge för aminosyra separation i figur 5. Fluorescensintensitet (i förhållande till LE eller TE zon intensitet) kan användas för zon identifiering, medan område bredder möjliggöra kvantifiering. <img alt="Figur 1." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig1.jpg" /> Figur 1. Isotakofores (ITP) är en elektrokinetisk teknik som används i mikroflödessystem applikationer för känslig detektion och separation av joner. ITP ger separation, selektiva fokusering och kapacitet förkoncentrering. Dessutom är det extremt robust och okänsligt för fysikaliska störningar på grund av dess självskärpande natur. Provjonerna fokusera selektivt mellan ett ledande (LE) och bakre elektrolyt (TE) och rör sig genom mikrokanalen vid en konstant hastighet som bestäms av hastigheten hos de ledande jonerna i LE zonen. Provjonernafokusera om deras faktiska elektroforetisk rörlighet omgärdad av effektiv rörlighet av Le och TE joner. Den schematiska visar en experiment-modell ITP där prov fokuserar kontinuerligt mellan LE och TE zoner. <img alt="Figur 2." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig2.jpg" /> Figur 2. Späd provjonerna fokus i &quot;topp läge&quot; ITP. a) Två distinkt utspädd (c prov &lt;&lt; c LE) arter fokus i topp läget vid gränssnittet bildas mellan LE och TE zoner. Enbart LE och TE bestämma det elektriska fältet, som provbeståndsdelar inte signifikant bidrar till ström. Exempel på joner blandas med TE (i en semi-oändligt injektion) och fokusera tillsammans i en ungefär Gaussisk topp vid ITP gränssnittet. Fokusering kriterium (visas eftersom orättvisor) gäller att starkt joniserade arter. b) Experiment visar Alexa Fluor 488 (AF488) fokuserade i toppen läge för en rad tillämpade strömmar (se även Video 1). Exempel på topp bredd är omvänt proportionell mot strömmen (för försumbar advektiv spridning på grund av elektroosmotiskt flöde) 14. Den självskärpande gränssnittet är resistent mot spridning på grund av tryck-driven flöde (se video 2). <img alt="Figur 3." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig3.jpg" /> Figur 3. Exempel på joner vid en tillräckligt hög koncentration fokus i &quot;platå läge&quot; och styr den lokala ledningsförmåga. Vi införa typiskt provjonerna i en ändlig injektion mellan TE och LE. I denna stödform, provjonerna separat och ordning enligt deras faktiska elektroforetisk rörlighet (se Video 3). För starkt joniserade arter är de TE och platån zon koncentrationerna bestäms genom Kohlrausch reglerande funktion (KRF, en invariant in initialt av LE zonen). Späd joner fortsätter att fokusera på topp läge mellan platån zonerna bracketing deras effektiva rörlighet. Fokusering criterion (visas eftersom orättvisor) gäller att starkt joniserade arter. <img alt="Figur 4." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig4.jpg" /> Figur 4. Lysat beredning och nukleinsyra extraktion med högsta mode ITP. Nukleinsyra extraheras från E. coli cellodling med lysozym-assisted alkaliska lyserings och renas genom selektiv elektrofores fokusera via ITP. TE blandat med lysat (brunt) innehåller målnukleinsyra (grön), proteiner och potentiella PCR-hämmande kemiska. Lämpligt val av bakre och främre joner möjliggör selektiv inriktning av målnukleinsyra medan PCR-inhibitorer bakom. Totalt nukleinsyra ITP toppen tar ofta på ett icke-ideal form, som visas här i infällda bilden. Som en demonstration av detta test, extraherades vi totala nukleinsyran från gramnegativa bakterier, Escherichia coli (lyserades med natriumhydroxidlösning enbart), renat NA från lysat med användning ITP, insamladeden extraherade genetiska materialet, och utfördes QRT-PCR-analyser för att bekräfta lyckad rening av 16S-rRNA (röd) och 16S rDNA (grön) från bakteriekultur. Negativa kontroll tröskel cykler för 16S rRNA (blå) och 16S rDNA (gul) var vardera över 30 cykler. Vi utförde QRT-PCR med Kraft SYBR Green RNA-till-C T 1-Step Kit från Applied Biosystems med 150 nM framåt (5&#39;-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) och omvända (5&#39;-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) grundfärg vid rekommenderade termiska cykling förhållanden. <img alt="Figur 5." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig5.jpg" /> Figur 5. Icke fokusering spårämne (NFT)-analys för separation och detektion av omärkta aminosyror. a) Schematisk ritning av NFT analysen. En ändlig injektion av provjonerna införes i öst-kanalen. Vi blandar LE med en tracer katjonisk fluorofor med effektiv mobilitet lägre än TE joner (μ spårämne &lt;μ TE). Fluoroforensägs fungera som en &quot;underspeeding spårämne&quot;. När fluoroforen electromigrates från LE i zoner som numera innehas av prov platåer och TE, upplever den högre elektriskt fält och därmed dess ökar koncentrationen. Denna förändring i koncentration skapar steg i isotachopherogram. b) Separation av två aminosyror, arginin och lysin, med användning av NFT analysen med rodamin 6G som underspeeding fluorescerande spårämne. Den obetydliga topp mellan TE och arginin är vanligt i ITP är inte väl förstådd, och här inte stör detektering eller kvantifiering av platåerna. Kompletterande Movie 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie1.mpg" target="_blank">Klicka här för att se kompletterande filmen</a> . Kompletterande Movie 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie2.mpg" target="_blank">Klicka här för att se kompletterande filmen</a> . Kompletterande Movie 3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie3.mpg" target="_blank">Klicka här för att se kompletterande filmen</a> .

<ol>
	<li>Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+millionfold+sample+stacking+using+transient+isotachophoresis.">On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).</li><li>Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+100+am+fluorophores+using+a+high-sensitivity+on-chip+CE+system+and+transient+isotachophoresis.">Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).</li><li>Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotachophoresis:+Theory,+instrumentation,+and+applications.">Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications.</a> Elsevier Science &#38; Technology. , (1976).</li><li>Khurana, T. K., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconcentration,+separation,+and+indirect+detection+of+nonfluorescent+analytes+using+fluorescent+mobility+markers.">Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers.</a> Anal. Chem. 80 (1), 279-279 (2008).</li><li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carrier+ampholytes+assay+for+portable,+label-free+detection+of+chemical+toxins+in+tap+water.">Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water.</a> Anal. Chem. 82 (5), 1858-1858 (2010).</li><li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+analyte+identification+using+isotachophoresis+and+a+fluorescent+carrier+ampholyte+assay.">Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay.</a> Anal. Chem. 82 (5), 2134-2134 (2010).</li><li>Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+system+for+isotachophoresis+assays.">Miniaturized system for isotachophoresis assays.</a> Lab Chip. 10 (17), 2242-2242 (2010).</li><li>Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+quantification+of+isotachophoresis+zones+using+nonfocusing+fluorescent+tracers.">Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers.</a> Anal. Chem. 81 (8), 3022-3022 (2009).</li><li>Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+extraction,+isolation,+preconcentration,+and+quantitation+of+small+RNAs+from+cell+lysate+using+on-chip+isotachophoresis.">Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis.</a> Lab Chip. 9 (15), 2145-2145 (2009).</li><li>Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+nucleic+acids+from+whole+blood+using+isotachophoresis.">Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).</li><li>Bercovici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+urinary+tract+infections+using+isotachophoresis+and+molecular+beacons.">Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).</li><li>Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+malaria-infected+erythrocytes+using+isotachophoresis.">Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).</li><li>Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+electrolyte+chemistry+for+microfluidic+electrokinetics.+Part+I:+Acid-base+equilibria+and+pH+buffers.">Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers.</a> Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).</li><li>Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+dispersion+in+isotachophoresis.">Sample dispersion in isotachophoresis.</a> J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).</li><li>Kohlrausch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+concentrations-verschiebungen+durch+electrolyse+im+inneren+von+l&#214;sungen+und+l&#214;sungsgemischen.">&#220;ber concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von l&#214;sungen und l&#214;sungsgemischen.</a> Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).</li><li>Alberty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+boundary+systems+formed+by+weak+electrolytes.+Theory+of+simple+systems+formed+by+weak+acids+and+bases.">Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).</li><li>Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphasic+zone+electrophoresis.+I.+Steady-state+moving-boundary+systems+formed+by+different+electrolyte+combinations.">Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations.</a> Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).</li><li>Persat, A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+by+simultaneous+selective+isotachophoresis+and+hybridization+with+molecular+beacons.">MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons.</a> Anal. Chem. , (2011).</li></ol>

Vi har inget att lämna ut.

De ITP metoderna presenteras här möjliggör snabb, känslig och robust upptäckt och hantering av joniska molekyler. Den största utmaningen i att använda ITP är korrekt val av LE och TE buffertar. I anjoniska ITP, väljer vi vanligtvis klorid som den ledande anjon eftersom det är en stark syra med mycket hög absolut rörlighet och därmed har mycket förutsägbara egenskaper. Därför buffert val anjoniska ITP normalt reduceras till att välja en lämplig TE och motjon. Selektiva fokus experiment är TE valet avgörande för uteslutande av kontaminerande joner. I tillämpningar där föroreningar inte finns leder lägre TE effektivt rörlighet snabbare fokusering. Vi rekommenderar att du använder följande relativt väl uppförde anjoniska TE joner: MES, MOPS, HEPES, tricin. Val av motjonen påverkar både pH-värde och TE effektiv rörlighet. Vanliga motjoner är tris (pKa 8,1) och bis-tris-(pKa 6,4). För analyser som kräver lägre eller högre pH, rekommenderar vi pyridin (pKa 5,25) ochetanolamin (pKa 9,5), respektive. I Tabellerna 1 och 2, för anjoniska och katjoniska ITP respektive sammanfattar vi flera användbara buffert exempel. Vi tar HCl som det anjoniska LE jon och natrium som katjoniska LE jon, och vi antar 100 mM jonstyrka av LE bufferten. Läsaren kommer att notera att styrka buffert joniska i våra protokoll (och i tabellerna 1-2) alltid är större än eller lika med 10 mm. Även i teorin fysik ITP gäller vid jonstyrka lägre än 10 mM, naturliga föroreningar (t.ex. kolsyra från reaktionen mellan vatten och koldioxid i atmosfären) i närheten av 1 mM nivån begränsar ofta den praktiska användningen av låg jonstyrka buffertar. Vi noterar att signaltransduktion mekanismen inte är begränsad till de analyser som presenteras i detta protokoll. Som diskuterats kortfattat i del 5, i Plateau mode renade områden kan upptäckas genom förändringar i lokal ledningsförmåga, UV absorbance, temperatur, eller brytningsindex. I vår egen grupp, har vi utvecklat en metod som utnyttjar fluorescerande bäraramfolyter för känslig detektion och identifiering av okända analyter. 5 I topp läge experiment kan specifika prober användas för att märka fokuserade analyter. I ett exempel använder vi molekylär fyrar - oligonukleotidsonder som fluorescerar vid hybridisering till sitt mål sekvens - att upptäcka mål-DNA eller RNA-molekyler med hög specificitet 11,18. Även ITP är relativt robust för spridning orsakad av tryck-driven flöde och EOF, kan överdriven EOF leda till stagnation i ITP gränssnitt där den genomsnittliga EOF hastigheten blir lika med ITP hastigheten 14. Så stark EOF förekommer, särskilt under förhållanden av högt pH och låg jonstyrka. Av denna anledning rekommenderar vi användning av buffertar med pH 8 eller lägre och med jonstyrka i storleksordningen 100 mm om lämpligt. Enligt vår erfarenhet är PVP imest effektiva beläggning för EOF undertryckande i borosilikatglas marker. Men på grund av dess siktning egenskaper kan PVP inte lämpligt för vissa applikationer, såsom fokus genomisk DNA. I experiment observerar vi att tillsats av PVP kraftigt kan minska DNA absoluta rörlighet (till den punkt där det inte fokus). I dessa fall en silanol beläggning såsom Sigmacote i samverkan med en tensid (t.ex. Triton-X 100) kan också vara effektiv i att reducera EOF. 10 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE anjon (pKa -1) </td></tr><tr><td> Buffring motjonen (pKa +1) </td><td> MES (6,10) </td><td> MOPS (7,20) </td><td> HEPES (7,50) </td><td> Tricin (8,15) </td></tr><tr><td> etanolamin (9,50) </td><td> 21,41 </td><td> 20,40 </td><td> 17,38 </td><td> 22,85 </td></tr><tr><td> tris (8,08) </td><td> 21,00 </td><td> 19,23 &lt;/ Td&gt; <td> 15,84 </td><td> 17,56 </td></tr><tr><td> Bis-Tris (6,40) </td><td> 18,22 </td><td> 10,41 </td><td> 7,30 </td><td> 5,23 </td></tr><tr><td> pyridin (5,18) </td><td> 1,01 </td><td> 3,72 </td><td> 2,42 </td><td> 1,48 </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Effektiv rörlighet magnitud (x 10 -9 m 2 / V / s) av justerat rent analyt zon i anjoniska ITP där LE är 100 mM HCl och 200 mM buffring motjon. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE ning (pKa +1) </td></tr><tr><td> Buffring motjonen (pKa -1) </td><td> etanolamin (9,50) </td><td> tris (8,08) </td><td> Bis-Tris (6,40) </td><td> pyridin (5,18) </td></tr><tr><td> MES (6,10) </td><td> 35,57 </td><td> 21,96 </td><td> 16,39 </td><td> 10,45 </td></tr><tr><td> MOPS (7,20) </td><td> 35,47 </td><td> 20,92 </td><td> 9,76 </td><td> 3,93 </td></tr><tr><td> HEPES (7,50) </td><td> 35,35 </td><td> 19,97 </td><td> 7,77 </td><td> 2,88 </td></tr><tr><td> Tricin (8,15) </td><td> 34,77 </td><td> 16,72 </td><td> 4,50 </td><td> 1,44 </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Effektiv rörlighet magnitud (x 10 -9 m 2 / V / s) av justerat rent analyt zon katjoniska ITP där LE är 100 mM natrium och 200 mM buffring motjon.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> REAGENSER </td></tr><tr><td> Namn </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Destillerat vatten </td><td> GIBCO </td><td> 10.977 </td><td> RNas / DNas fritt </td></tr><tr><td> Clorox Ultra </td><td> Clorox </td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td> natriumhydroxid (NaOH) </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td> saltsyra (HCl) </td><td> EMD Chemicals </td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma-bas (tris) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> polyvinylpyrrolidon (PVP) </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 06.067 </td><td> MW 1.000.000 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> ^ H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 karboxylsyra </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> tricin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td> Bis-Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> lysozym </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green II </td><td> Invitrogen </td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td> etanolamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 411 tusen </td><td></td></tr><tr><td> Rodamin 6G </td><td> Acros Organics (Geel, Belgien) </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-aminosyror </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> Effekt SYBR Green RNA-till-C T 1-Step Kit </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;TD&gt; PCR primers </td><td> Integrerade DNA-teknik </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> UTRUSTNING </td></tr><tr><td> Namn </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Borsilikat mikrofluidanordning chip </td><td> Caliper Life Sciences Inc. </td><td> NS12A </td><td> Levereras med eller utan plast caddie </td></tr><tr><td> Vakuumpump </td><td> Gast </td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td> Sourcemeter </td><td> Keithley </td><td> 2410 </td><td> Konstant ström och konstant spänning driftlägen </td></tr><tr><td> Inverterat epifluorescensmikroskop </td><td> Olympus </td><td> IX70 </td><td> Använd kvicksilverlampa (Olympus) eller LED (Thorlabs) för belysning </td></tr><tr><td> Filtret kub </td><td> Omega </td><td> XF115-2 </td><td> Excitation / emission: blå / grön </td></tr><tr><td> Säkert-Lås mikrocentrifugrör </td><td> Eppendorf </td><td> 022363204 </td><td> 1,5 ml kapacitet </td></tr><tr><td> Centrifugera </td><td> Eppendorf </td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 3. Specifika reagens och utrustning.

on-chip isotachophoresis for separation of ions and purification of nucleic acids

Elektrokinetiska tekniker är en stapelvara i mikroskala tillämpningar på grund av sin unika förmåga att utföra en rad olika fluida och elektrofores processer i enkla, kompakta system med inga rörliga delar. Isotakofores (ITP) är en enkel och robust elektrokinetiska teknik som kan åstadkomma miljon gånger förkoncentrering 1,2 och effektiv separation och utvinning baserat på jonisk mobilitet. 3 Till exempel, har vi visat att applicering av ITP till separation och känslig detektering av omärkt joniska molekyler (t.ex. toxiner, DNA, rRNA, Mirna) med liten eller ingen provberedning 4-8 och till utvinning och rening av nukleinsyror från komplexa matriser, inklusive cellodling, urin och blod. 9-12 ITP uppnår fokusering och separation med användning av ett pålagt elektriskt fält och två buffertar inom en fluidisk kanalsystem. För anjoniska analyter, är den ledande elektrolyt (LE) buffert vald sn sådan att dess anjoner har högre effektiv elektroforetisk mobilitet än de anjoner av den bakre elektrolyt (TE)-buffert (effektiv rörlighet beskriver den observerbara drifthastighet av en jon och tar hänsyn till jonisering tillstånd jon, såsom beskrivs i detalj av Persat et al . 13). Efter upprättande av ett gränssnitt mellan TE och LE är ett elektriskt fält appliceras så att LE joner rör sig bort från området ockuperat av TE joner. Exempel på joner av intermediär effektiv rörlighet race före TE joner men kan inte köra LE joner, och så att de fokuserar på LE-TE gränssnitt (nedan kallad &quot;ITP-gränssnittet&quot;). Ytterligare, TE och LE regioner bilda av respektive låg och hög ledningsförmåga, som skapar en brant elektriskt fält lutning på ITP-gränssnittet. Detta fält gradient preconcentrates provbeståndsdelar som de fokusera. Korrekt val av TE-och LE resulterar i att fokusera och rening av målart från andra icke-fokuserade arter och slutligen separation ettd segregation av prov arter. Vi granskar här fysiska principerna för ITP och diskutera två standard driftsformer &quot;topp&quot; och &quot;platå&quot; lägen. I topp läge relativt utspädd provjonerna fokusera tillsammans inom överlappande smala toppar på ITP-gränssnittet. I platå läge rikligare provjonerna nå en steady-state koncentration och segregerar i angränsande platåliknande zoner sorteras efter effektiv rörlighet. Peak och platå lägen uppstår ur samma underliggande fysiken, men representerar olika regimer uppdelade efter den initiala analytkoncentrationen och / eller den tid som avsatts för prov ackumulering. Vi beskriver först i detalj en modell experiment topp läge och sedan visar en topp-läge analys för utvinning av nukleinsyror från E. coli cellkultur. Vi avslutar med att presentera en analys platå läge, där vi använder en icke-fokus spårämne (NFT) arter att visualisera separationen och perbilda kvantifiering av aminosyror.

Watch this Scientific Journal Video about On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids at JoVE.com

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Isotakofores (ITP) är en robust elektrokinetisk separation och förkoncentrering teknik med tillämpningar som sträcker sig från toxin upptäckt att provberedning. Vi går igenom de fysikaliska principerna för ITP och metoder att tillämpa denna teknik på två specifika exempel applikationer: separation och detektion av små molekyler och rening av nukleinsyror från cellodling lysat.

On-chip isotakofores för separation av joner och rening av nukleinsyror

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Bioengineering

Unit 1

Current and Resistance

SCIENTISTS IN ACTION

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Tillverkning av elektrokemiska-DNA biosensorer för att Reagentless Upptäckt av nukleinsyror, proteiner och små molekyler

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Lensfree On-chip tomografiska Mikroskopi Använda Multi-vinkel belysning och Pixel Super upplösning

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

On-Chip Endothelial inflammatorisk Fenotypning

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Expression, isolering och rening av lösliga och olösliga Biotinylerade Proteiner för Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Syntes av Hydrogeler med Antifouling egenskaper som Membran för vattenrening

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Torr Film fotoresist-baserade elektrokemiska mikroflödessystem Biosensor plattform: Enhet Fabrication, On-chip Assay förberedelse och systemdrift

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Tillverkning och validering av en orgel-on-chip System med integrerad elektroder direkt kvantifiera Transendothelial resistans

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Visuell identifiering av flera Nucleic syror i en kapillär matris

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Förberedelse, rening och användning av fettsyra-innehållande liposomer

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Antimikrobiella peptider produceras av selektionstryck införlivandet av icke-kanoniska aminosyror

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...