Name: protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water
Uploaded: 2013-02-20T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796.

Les présentées Léo-workflows permettent l&#39;étiquetage des isotopes stables de protéines et de peptides synthétiques digère. Ces expériences suivies dans le temps (figure 1) sont applicables aux études comparatives et quantitatives protéomique ainsi que la recherche de protéase. Chaque flux de travail se compose de deux étapes expérimentales (figure 2): A) Le temps d&#39;échantillonnage résolu de l&#39;respectif 18 O-isotope stable codé réaction (protéase ...

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	<li>Bender, M., Kemp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-18+Studies+of+the+Mechanism+of+the+alpha-Chymotrypsin-catalyzed+Hydrolysis+of+Esters.">Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters.</a> Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).</li><li>Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pepsin-catalyzed+exchange+of+oxygen+atoms+between+water+and+carboxylic+acids.">Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).</li><li>Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanisms+of+action+of+proteolytic+enzymes+using+heavy+oxygen+exchange.">Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange.</a> European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).</li><li>Fenselau, C., Yao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18O2-labeling+in+quantitative+proteomic+strategies:+a+status+report.">18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).</li><li>Miyagi, M., Rao, K. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+18O-labeling+strategies+for+quantitative+proteomics.">Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics.</a> Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).</li><li>Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18O+stable+isotope+labeling+in+MS-based+proteomics.">18O stable isotope labeling in MS-based proteomics.</a> Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).</li><li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics:+a+critical+review.">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).</li><li>Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+proteolytic+18O+labeling:+endoprotease-catalyzed+16O-to-18O+exchange+of+truncated+peptide+substrates.">Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates.</a> Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).</li><li>Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometry-based+strategy+for+detecting+and+characterizing+endogenous+proteinase+activities+in+complex+biological+samples.">A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples.</a> Proteomics. 8, 435-445 (2008).</li><li>Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+endothelin-converting+enzyme-1:+a+regulator+of+beta-arrestin-dependent+ERK+signaling.">Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).</li><li>Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemoglobin+cleavage+site-specificity+of+the+Plasmodium+falciparum+cysteine+proteases+falcipain-2+and+falcipain-3.">Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3.</a> PLoS ONE. 4, e5156 (2009).</li><li>Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+automatically+interpreting+mass+spectra+of+18O-labeled+isotopic+clusters.">A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).</li><li>Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+and+identification+using+18O+labeling+with+an+ion+trap+mass+spectrometer+and+the+analysis+software+application+"ZoomQuant&amp;quot.">Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant&amp;quot.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).</li><li>Qian, W. -. J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-catalyzed+oxygen-18+labeling+for+quantitative+proteomics.">Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics.</a> Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).</li><li>Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+method+for+computing+(18)O/(16)O+ratios+of+differentially+stable-isotope+labeled+peptides+in+the+context+of+postdigestion+(18)O+exchange/labeling.">Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling.</a> Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).</li><li>Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+proteolytic+processes+in+human+cancer+microenvironments+by+microdialysis+and+activity-based+mass+spectrometry.">Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry.</a> Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).</li><li>Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FindPept,+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification.">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+'de+novo'+peptide+sequencing+by+a+combination+of+nanoelectrospray,+isotopic+labeling+and+a+quadrupole/time-of-flight+mass+spectrometer.">Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).</li><li>Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides.">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li><li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water.">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li></ol>

En combinant l&#39;étiquetage des isotopes stables et la spectrométrie de masse à haute résolution dans un temps résolu manière, la méthode paléo-TimeCourse permet une analyse dynamique de la production de produits peptidiques. Le test peut être utilisé pour générer des peptides marqués par des isotopes stables pour les études protéomiques quantitatives et qualitatives pour évaluer la cinétique de peptides qui protéotypiques sont générés. En outre, le Paléo-TimeCourse est conçu pour évaluer voies...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du matériau </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Colonnes PepClean C-18 Spin </td><td> Thermo </td><td> 89870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF plaque 384 cible MALDI </td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Matériaux <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Alpha cyano-4-hydroxycinnamique </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Dithiothréitol (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Iodoacétamide (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> L&#39;endothéline-1 converting enzyme (CEE-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Or la trypsine </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Eau-18 O, 97% atomique 18 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td> L&#39;acide trifluoroacétique (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> Kit de masse pour l&#39;étalonnage des normes AB SCIEX TOF / TOF instruments </td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Réactifs

protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water

Les isotopes stables sont des outils essentiels pour la spectrométrie de masse biologique. Historiquement, 18 O-isotopes stables ont été largement utilisées pour étudier les mécanismes catalytiques des enzymes protéolytiques 1-3. Avec l&#39;avènement de la spectrométrie de masse à base de protéomique, l&#39;incorporation enzymatique catalysée de 18 atomes d&#39;oxygène de l&#39;eau isotopiquement enrichi stable est devenue une méthode populaire de comparer quantitativement les niveaux d&#39;expression de protéines (revue par Fenselau et Yao 4, Miyagi et Rao 5 et Ye et al. 6). 18 O-étiquetage constitue une alternative simple et peu coûteuse aux produits chimiques (par exemple iTRAQ, ICAT) et métaboliques (par exemple les techniques de marquage SILAC) 7. En fonction de la protéase utilisée, 18 O-étiquetage peut conduire à la prise en compte d&#39;un maximum de deux atomes d&#39;oxygène 18 dans le groupe carboxyle C-terminal du produit de clivage 3 </sup&gt;. La réaction de marquage peut être subdivisé en deux processus indépendants, le clivage liaison peptidique et la réaction de l&#39;oxygène carboxyle échange 8. Dans notre Paléo (p-rotease un e ssisted l Abeling mploying 18 O de l&#39;eau enrichie) l&#39;adaptation des enzymatique 18 O-étiquetage, nous avons utilisé 50% 18 O de l&#39;eau enrichie pour produire des signatures isotopiques distinctes. En combinaison avec haute résolution assistée par matrice ionisation par désorption laser à temps de vol tandem spectrométrie de masse (MALDI-TOF/TOF MS / MS), les enveloppes des isotopes caractéristiques peuvent être utilisées pour identifier des produits de clivage avec un degré élevé de spécificité. Nous avons précédemment ont utilisé le paléo-méthodologie pour détecter et caractériser les protéases endogènes 9 et surveiller les réactions protéolytiques 10-11. Depuis Paléo code l&#39;essence même de la réaction de clivage protéolytique, le dispositif expérimental est enri simple et biochimiqueétapes chment de produits de clivage peut être contournée. Le paléo-méthode peut facilement être étendue à (i) des expériences suivies dans le temps qui surveillent la dynamique des réactions de clivage protéolytique et (ii) l&#39;analyse de la protéolyse dans des échantillons biologiques complexes qui représentent des conditions physiologiques. Paléo-TimeCourse expériences permettent d&#39;identifier les étapes de traitement de limitation de vitesse et les intermédiaires de réaction à complexes réactions protéolytiques voie. En outre, la paléo-réaction nous permet d&#39;identifier des enzymes protéolytiques telles que la trypsine sérine-protéase qui est capable de relier ses produits de clivage et de catalyser l&#39;incorporation d&#39;un 18 second joint atome. Ces «double étiquetage&quot; enzymes peuvent être utilisées pour postdigestion 18 O-étiquetage, dans laquelle les peptides sont exclusivement marqués par la réaction d&#39;échange d&#39;oxygène carboxyle. Notre troisième stratégie s&#39;étend étiquetage employant 18 O de l&#39;eau enrichie au-delà des enzymes et utilise conditions de pH acide à introduire 18 Signe isotope O-stablepératures en peptides.

Nous avons utilisé le flux de travail paléo-TimeCourse de surveiller dynamiquement l&#39;incorporation de 18 S-isotopes stables dans les produits de clivage de peptides générés par des enzymes protéolytiques. L&#39;approche présentée est un outil polyvalent pour étudier les voies relativement traitement protéolytique de substrat différent et les combinaisons de protéase. En échantillonnant les réactions protéolytiques à plusieurs reprises au cours de la réaction, l&#39;expérience paléo-Time...

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Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Stable workflows marquage isotopique qui emploient<sup&gt; 18</sup&gt; O-eau enrichie (Leo-workflows) sont des outils polyvalents pour les études protéomiques quantitatives et qualitatives. En workflows protéase assistée (paléo),<sup&gt; 18</sup&gt; Atomes d&#39;oxygène sont introduits par clivage protéolytique et carboxyle réactions d&#39;échange d&#39;oxygène médiée par les protéases. Dans la catalyse acide (Aleo) flux de travail,<sup&gt; 18</sup&gt; Atomes d&#39;oxygène sont introduits par échange d&#39;oxygène carboxyle à faible pH.

Flux de travail d&#39;étiquetage protéase et catalysée par un acide Embauche<sup&gt; 18</sup&gt; O enrichi en eau

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

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