Name: protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water
Uploaded: 2013-02-20T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom NIH / NIDCR Stipendium 1R01DE019796 unterstützt.

Die vorgestellten LeO-Workflows ermöglichen die stabile Isotopenmarkierung von Proteinverdaus und synthetischen Peptiden. Diese zeitliche Verlauf Experimente (Abbildung 1) sind für vergleichende und quantitativen Proteomik Studien sowie Protease Forschung. Jeder Workflow besteht aus zwei experimentellen Schritte (Abbildung 2): A) Die zeitaufgelöste Abtastung des jeweiligen 18 O-stabilen Isotopen-codierten Reaktion (Protease-katalysierten Peptidspaltung; Protease-katalysier...

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	<li>Bender, M., Kemp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-18+Studies+of+the+Mechanism+of+the+alpha-Chymotrypsin-catalyzed+Hydrolysis+of+Esters.">Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters.</a> Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).</li><li>Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pepsin-catalyzed+exchange+of+oxygen+atoms+between+water+and+carboxylic+acids.">Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).</li><li>Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanisms+of+action+of+proteolytic+enzymes+using+heavy+oxygen+exchange.">Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange.</a> European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).</li><li>Fenselau, C., Yao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18O2-labeling+in+quantitative+proteomic+strategies:+a+status+report.">18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).</li><li>Miyagi, M., Rao, K. 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Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).</li><li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics:+a+critical+review.">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).</li><li>Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+proteolytic+18O+labeling:+endoprotease-catalyzed+16O-to-18O+exchange+of+truncated+peptide+substrates.">Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates.</a> Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).</li><li>Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+endothelin-converting+enzyme-1:+a+regulator+of+beta-arrestin-dependent+ERK+signaling.">Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).</li><li>Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemoglobin+cleavage+site-specificity+of+the+Plasmodium+falciparum+cysteine+proteases+falcipain-2+and+falcipain-3.">Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3.</a> PLoS ONE. 4, e5156 (2009).</li><li>Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+automatically+interpreting+mass+spectra+of+18O-labeled+isotopic+clusters.">A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).</li><li>Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+and+identification+using+18O+labeling+with+an+ion+trap+mass+spectrometer+and+the+analysis+software+application+"ZoomQuant&amp;quot.">Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant&amp;quot.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).</li><li>Qian, W. -. J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-catalyzed+oxygen-18+labeling+for+quantitative+proteomics.">Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics.</a> Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).</li><li>Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+method+for+computing+(18)O/(16)O+ratios+of+differentially+stable-isotope+labeled+peptides+in+the+context+of+postdigestion+(18)O+exchange/labeling.">Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling.</a> Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).</li><li>Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. 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G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+'de+novo'+peptide+sequencing+by+a+combination+of+nanoelectrospray,+isotopic+labeling+and+a+quadrupole/time-of-flight+mass+spectrometer.">Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).</li><li>Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides.">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li><li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water.">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li></ol>

Durch die Kombination von stabilen Isotopenmarkierung und hochauflösende Massenspektrometrie in einer zeitaufgelösten Weise ermöglicht die Paleo-Zeitverlauf-Methode für eine dynamische Analyse der Erzeugung von Peptid-Produkte. Der Assay kann verwendet werden, um stabile isotopenmarkierte Peptide für die quantitative und qualitative Proteomstudien erzeugen und die Kinetiken, mit denen proteotypischen Peptiden erzeugt werden ausgewertet werden. Weiterhin ist Paleo-Zeitverlauf zur proteolytischen Wege unter spezielle...

<table border="1"><tbody><tr><td> Bezeichnung des Gutes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> PepClean C-18 Spin Columns </td><td> Thermo </td><td> 89870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF 384 MALDI Zieltafel </td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Materials <table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Alpha cyano-4-Hydroxyzimtsäure </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70.990-1G-F </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Iodacetamid (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Trypsin Gold- </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Wasser-18 O, 97 O 18 Atom% </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329.878-1G </td></tr><tr><td> Trifluoressigsäure (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> Messe Standards Kit zur Kalibrierung von AB SCIEX TOF / TOF-Geräte </td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Reagenzien

protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water

Stabile Isotope sind unverzichtbare Werkzeuge in der biologischen Massenspektrometrie. Historisch gesehen, haben 18 O-stabilen Isotopen wurde ausgiebig genutzt, um die katalytischen Mechanismen von proteolytischen Enzymen 1-3 studieren. Mit dem Aufkommen der Massenspektrometrie basierenden Proteomik ist die enzymatisch-katalysierten Einbau von 18 O-Atomen, die aus stabilen Isotopen angereicherte Wasser zu einem beliebten Methode quantitativ zu vergleichen Proteinexpression Ebenen (Übersichtsartikel von Fenselau und Yao 4, Miyagi und Rao 5 und Ye et al. 6). 18 O-Kennzeichnung stellt eine einfache und preiswerte Alternative zur chemischen (zB iTRAQ, ICAT) und metabolische (zB SILAC) Markierungstechniken 7. Abhängig von der Protease verwendet wird, kann 18 O-Kennzeichnung in der Einarbeitung von bis zu zwei 18 O-Atomen in der C-terminalen Carboxylgruppe der Spaltprodukt 3 führen </sup&gt;. Die Markierungsreaktion kann in zwei unabhängige Prozesse, die Peptidbindungsspaltung und die Carboxyl Sauerstoff Austauschreaktion 8 unterteilen. In unserem Paléo (p rotease-a ssisted l Abeling e mploying 18 O-angereichertem Wasser) Anpassung der enzymatischen 18 O-Kennzeichnung, verwendeten wir 50% 18 O-angereichertem Wasser Unterscheidungskraft Isotopensignaturen ergeben. In Kombination mit hochauflösende Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation Time-of-Flight-Tandem-Massenspektrometrie (MALDI-TOF/TOF MS / MS) können die charakteristischen Isotop Umschläge zu Spaltprodukten mit einem hohen Maß an Spezifität zu identifizieren. Wir haben vorher haben die Paläo-Methodik zur Erfassung und Charakterisierung endogene Proteasen 9 und überwachen proteolytische Reaktionen 10-11. Da Paleo kodiert das Wesen der proteolytischen Spaltung, ist der Versuchsaufbau einfache und biochemische enrichment Schritte von Spaltprodukten umgangen werden kann. Das Paléo-Verfahren kann leicht an (i) Zeitverlauf Experimente, die die Dynamik der proteolytischen Spaltung Reaktionen und (ii) die Analyse der Proteolyse in komplexen biologischen Proben, die physiologischen Bedingungen stellen zu überwachen erweitert werden. Paleo-Zeitverlauf Experimente helfen identifizieren geschwindigkeitsbestimmenden Verarbeitungsschritte und Intermediate in komplexen proteolytischen Stoffwechselweg Reaktionen. Weiterhin erlaubt die Paleo-Reaktion wir proteolytische Enzyme wie die Serinprotease Trypsin, die fähig, ihre Spaltprodukte binden und katalysieren den Einbau eines zweiten 18 O-Atom ist identifizieren. Solche &quot;double-Kennzeichnung&quot; Enzyme können für postdigestion 18 O-Kennzeichnung, bei denen Peptide ausschließlich durch die Carboxyl-Sauerstoff-Austausch sind beschriftet werden. Unsere dritte Strategie erstreckt Kennzeichnung beschäftigt 18 O-angereichertem Wasser über Enzyme und nutzt sauren pH-Bedingungen, um 18 O-stabilen Isotopen Zeichen einzuführenturen in Peptide.

Wir nutzten die Paleo-Zeitverlauf Workflow dynamisch überwachen den Einbau von 18 O-stabilen Isotopen in Peptid Spaltprodukte durch proteolytische Enzyme erzeugt. Der vorgestellte Ansatz ist ein vielseitiges Werkzeug vergleichsweise studieren proteolytische Prozessierung Wege für unterschiedliche Substrat und Protease-Kombinationen. Durch Abtasten proteolytischen Reaktionen wiederholt über den Verlauf der Reaktion stellt das Paleo-Zeitverlauf Experiment zeitaufgelösten Momentaufnahmen von Substrat und Pro...

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Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Stabile Isotopenmarkierung Workflows Einsatz<sup&gt; 18</sup&gt; O-angereichertem Wasser (Leo-Workflows) sind vielseitige Werkzeuge zur quantitativen und qualitativen Proteomstudien. In Protease-assisted (Paleo) Workflows,<sup&gt; 18</sup&gt; O-Atome werden durch proteolytische Spaltung und Carboxyl-Sauerstoff-Austausch durch Proteasen vermittelt eingeführt. In der Säure-katalysierten (Aleo) Workflow,<sup&gt; 18</sup&gt; O-Atome durch Carboxyl Sauerstoffaustausch bei niedrigen pH eingeführt.

Protease-und Acid-katalysierten Labeling Workflows beschäftigt<sup&gt; 18</sup&gt; O-angereichertem Wasser

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Mess-Exocytose in Neuronen mit FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Forschung

Biologie

Morris Water Maze Experiment

Morris Water Maze-Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Sigma Unspezifische Protease Activity Assay - Casein als Substrat

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluoreszenzmarkierung Drosophila Herz Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

Die Nutzung der Protease Fluorescent Detection Kit für Protease-Aktivität zu bestimmen

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Maus Islet der Langerhans Isolation durch eine Kombination von gereinigtem Collagenase und Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Bestimmen Membrane Protein Topologie Mit Fluorescence Protease Schutz (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

TEM Workflows, Results Analysis, and Data Management Using a Machine-Vision Approach

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management (Video) | JoVE 

Ein Machine-Vision-Ansatz für Transmissionselektronenmikroskopie-Workflows, Ergebnisanalyse und Datenmanagement

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate ...

High-Throughput Screening Analysis for 4B Cysteine Peptidase Autophagy Inhibitor

Cell-Based Drug Screening for Inhibitors of Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase

A Selective Luciferase-Based Assay for Monitoring ATG4B 27 Activity in Cells (Video) | JoVE

Zellbasiertes Wirkstoff-Screening auf Inhibitoren der Autophagie-verwandten 4B-Cystein-Peptidase

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